白花樹SRAP—PCR反應體系的建立與優(yōu)化

柳新紅，李 楠，李因剛，徐 梁，盛煒彤，惠剛盈，鄭勇奇

（1. 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. 浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

白花樹SRAP—PCR反應體系的建立與優(yōu)化

柳新紅1,2，李 楠2，李因剛2，徐 梁2，盛煒彤1，惠剛盈1，鄭勇奇1

（1. 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. 浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

以白花樹葉片的總DNA為模板，通過正交試驗設計，確定了適合白花樹的SRAP-PCR的20 μL最佳反應體系為：24 ng模板DNA，2.0 mM的Mg2+，0.5 mM的dNTPs，1.25uM的引物，1.5 U的Taq DNA聚合酶，2 μL的10× PCR緩沖液。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，特征性條帶清晰，信息量大，穩(wěn)定。

白花樹；SRAP-PCR；反應體系；正交設計

白花樹（Styrax tonkinensis）又名越南安息香、滇桂野茉莉、白背安息香，屬安息香科安息香屬落葉喬木，是熱帶和亞熱帶樹種，分布于我國的云南、廣東、廣西、貴州、福建、湖南、江西、重慶等?。ㄊ?、區(qū)）以及越南、老撾等國[1]。該樹種生長迅速，成材期短，萌芽力強[2]，是制漿、造紙等短周期工業(yè)原料林的首選樹種之一；同時該樹種結(jié)果量大，早實豐產(chǎn)，種子含油率高，也是材、油兼用的優(yōu)良生物質(zhì)能源樹種。此外，白花樹樹脂“安息香”，含較多香脂酸，是貴重藥材[3]，有防腐、消炎、祛痰、行氣血之效，并可制造高級香料。

相關序列擴增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）標記是基于聚合酶鏈式反應（PCR）的新型分子標記技術(shù)[4]。該標記根據(jù)基因外顯子中GC含量豐富的內(nèi)含子、啟動子中AT含量豐富的特點，設計一對適宜引物進行PCR擴增，因不同個體的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)的長度差異而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP標記與RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）、SSR（Simple Sequence Repeat）等分子標記技術(shù)相比，具有技術(shù)簡單、快速、引物設計簡單、多態(tài)性和信息量豐富、在基因組中分布均勻、便于克隆測序目標片段、實驗成本低等優(yōu)點，尤其是與ISSR、RAPD等以隨機引物為基礎的分子標記相比，SRAP可檢測基因的可譯框或調(diào)控區(qū)域，擴增結(jié)果可能與基因的編碼區(qū)域或調(diào)控區(qū)域直接相關，因而獲得的差異擴增DNA條帶將直接與基因關聯(lián)，從而將個體的性狀差異與特異基因連鎖[5～10]，在遺傳學和育種學領域具有廣泛的應用前景。

目前，還沒有分子標記技術(shù)在白花樹上應用的研究報道，相對阻礙了白花樹遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位等方面的研究。因此，本研究擬先通過優(yōu)化白花樹的SRAP-PCR反應體系，為進一步開展白花樹分子遺傳學與標記輔助育種等研究奠定基礎，以期推動這一優(yōu)良樹種的研究利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料采集于白花樹分布相對集中的云南、廣西、廣東、福建、江西、湖南、重慶和貴州8個?。▍^(qū)、市）和越南等地，共20份種質(zhì)，296份材料。

試驗所用Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs均購自TaKaRa公司；SRAP引物采用的組合[4,11～12]見表1、表2，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

表1 SRAP正向引物及其序列Table 1 Sequcnccs(5'-3’)of SRAP forward primers used in this research

表2 SRAP反向引物及其序列Table 2 Sequences(5’-3’)of SRAP reverse primers used in this research

1.2 實驗方法

1.2.1 白花樹總DNA的提取 采用CTAB 法提取白花樹葉片的總DNA，DNA粗提物再經(jīng)Magabio核酸純化試劑盒（Bioer，杭州）進行純化。純化后的DNA樣品分別用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和DNA/RNA紫外分光光度計（GeneQuant Pro，GE Healthcare）進行定性和定量檢測。

1.2.2 引物篩選 SRAP的反應程序參考Li和Quiros等的方法[13]，并在此基礎上有所改進，將35個循環(huán)中的退火溫度由50℃提高到52℃，進行引物的初步篩選，所得引物用于反應體系優(yōu)化實驗。擴增反應在博日PCR儀上進行，擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃ 延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。本研究采用20 μL基本PCR反應體系，反應體系見表3。PCR產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表3 白花樹SRAP-PCR原始反應體系（20μL）Table 3 The parameters of SRAP-PCR of S. tonkinensis（20 μL）

1.2.3 SRAP-PCR反應因素水平的確定與正交表的設計 為了確定 PCR反應中5個因素的最佳水平，采用正交設計L16(45)在 4個水平上進行試驗。參與PCR反應的因素水平見表4，L16(45)正交設計方案見表5。

1.2.4 擴增產(chǎn)物的檢測 PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察分析條帶，得到白花樹的SRAP-PCR反應5個因素的最佳水平及組合。

1.2.5 SRAP-PCR反應體系的確立 以上述確定的條件，用初篩的引物組合對隨機選取的DNA模板分別進行擴增，對優(yōu)化過的SRAP反應體系的穩(wěn)定性進行檢測。

表4 白花樹SRAP-PCR反應因素水平Table 4 Factors and levels of SRAP-PCR reaction in S. tonkinensis

表5 白花樹SRAP-PCR反應因素水平L16(45)正交設計Table 5 Orthogonal design for SRAP-PCR optimization in S. tonkinensis

2 結(jié)果與分析

2.1白花樹基因組DNA的提取

用CTAB法提取DNA，電泳檢測結(jié)果顯示，獲得的DNA樣品量大，條帶清晰（圖1）。經(jīng)DNA/RNA紫外分光光度計進行定性和定量檢測，僅OD260／OD280 >1.8的DNA樣品方可用于下面的PCR反應。

圖1 20個白花樹樣品DNA電泳結(jié)果Figure 1 The electrophoresis results of twenty DNA from S. tonkinensis

2.2 引物篩選試驗

從20份種源中隨機各挑選一個DNA樣品，共20個PCR擴增模板，進行引物初篩。從9個SRAP正向引物和22個反向引物組合成的198個組合中，篩選出適于不同白花樹種源遺傳分析的引物8對（表6）。從篩選的引物中選取條帶適中且清晰的Me1/Em8引物組合（圖2），進行SRAP-PCR反應體系優(yōu)化實驗。

表6 適于不同白花樹種源SRAP分析的引物Table 6 Primers suitable for SRAP analysis in S. tonkinensis

2.3 PCR反應體系的優(yōu)化

2.3.1 正交實驗結(jié)果分析 按照表5正交試驗設計的16個反應體系進行擴增，隨機選擇1個白花樹DNA模板進行試驗。L16(45)正交試驗PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3，擴增體系是否適合，關鍵是擴增結(jié)果所反應的信息量，即凝膠電泳圖片中的有效條帶數(shù)量和清晰度，按照遺傳多樣性分析要求，對PCR擴增結(jié)果進行分析，以條帶數(shù)量豐富、清晰度高作為評價標準。初步選出9號和12號處理，并用于反應體系的再次篩選。其他處理表現(xiàn)出條帶模糊或缺失，或是出現(xiàn)非特異性擴增，都不符合預期的目標。

圖2 Me1/Em8引物組合PCR擴增結(jié)果Figure 2 The SRAP amplified result by the primer pair Me1/Em8

圖3 SRAP-PCR擴增正交試驗電泳結(jié)果Figure 3 The results of SRAP-PCR system with orthogonal design

2.3.2 PCR反應體系的篩選 從20個白花樹種源中再隨機挑選8個DNA樣品，進行反應體系的再次篩選，并將原始反應體系設為對照。從圖4可以看出，每個樣品的3個處理，12號相比9號和對照來說，條帶數(shù)量清晰且較豐富，每個泳道都有條帶擴增。PCR反應中對模板濃度要求的范圍較寬，一般每個反應中5 ～ 500 ng DNA都能提供好的結(jié)果，但不同物種的DNA進行PCR擴增時，適合的濃度不同[14]。結(jié)合實驗分析結(jié)果和節(jié)約實驗材料角度綜合考慮，本試驗選擇20 μL體系終濃度24 ng為模板最佳濃度水平。

圖4 9號、12號處理和對照的SRAP-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 4 The influence of different treatments on amplified result

2.3.3 優(yōu)化體系的應用 以優(yōu)化的體系，用Me3/Em8、Me4/Em8、Me6/Em16引物組合分別對隨機選取的白花樹DNA樣品進行擴增（圖5），電泳檢測擴增譜帶清晰、多態(tài)性強、穩(wěn)定性好，該體系適合白花樹SPAP-PCR反應。

圖5 3個引物組合在部分DNA樣品上的擴增Figure 5 The influence of 3 primers on amplified product

3 結(jié)論與討論

SRAP已被成功應用于多種植物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀標記以及相關基因克隆等，如響葉楊×銀白楊（Populus adenopoda×P. alba）[15]、柿樹（Diospyros kaki）[16]、紅松（Pinus koraiensis）[17]、青葙（Celosia argentea）[18]、甘藍型油菜（Brassica napus）[19]、菊花（Chrysanthemum morifolium）[20]、甜瓜（Cucumis melo）[21]等。SRAP分子標記是基于PCR的標記，其反應條件易受各種因素的干擾，對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究首次構(gòu)建了白花樹的SRAP-PCR反應體系，并對模板DNA濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶等因子進行了優(yōu)化，建立了一套適合白花樹的SRAP-PCR反應體系。通過研究，確定了白花樹SRAP-PCR 20 μL反應體系中，用24 ng模板DNA，2.0 mM的Mg2+，0.5 mM的dNTPs，1.25 uM的引物，1.5 U的Taq DNA聚合酶，2 μL的10×PCR緩沖液為最優(yōu)的SRAP-PCR反應組合。此反應體系能擴增出多態(tài)性強，條帶清晰，重復性好的結(jié)果，能夠應用于白花樹的分子標記分析，該體系為進一步應用于白花樹的遺傳多樣性分析、遺傳格局研究和種質(zhì)鑒別奠定了基礎。

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Optimization of SRAP-PCR System for Styrax tonkinensis

LIU Xin-hong1,2，LI Nan2，LI Yin-gang2，XU Liang2，SHENG Wei-tong1，HUI Gang-ying1，ZHENG Yong-qi1
（1. Institute of Forestry Research, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China）

The reaction system was established based on total DNA extracted from Styrax tonkinensis leaves, by using orthogonal design of L16(45)，which is the first report of S. tonkinensis SRAP-PCR reaction system. The optimal PCR system is as follows: 24 ng genomic DNA templates,1.0 mM Mg2+,1 mM dNTPs,0.75 uM primer,1.5 U/20μL Taq DNA polymerase and 2μL 10×PCR buffer in 20 μL reaction system. The clear, stable and abundant polymorphism bands were obtained by using above reaction systems. The results can be lay a foundation for studying genetic differentiation and construction of genetic map from different S. tonkinensis.

Styrax tonkinensis; orthogonal design; SRAP-PCR; system optimization

S718.43

A

1001-3776（2011）06-0030-05

2011-06-09；

2011-09-20

浙江省重大科技專項“食用油料與能源植物定向培育及開發(fā)利用研究”（2008C12019），浙江省院合作林業(yè)科技項目“早實高產(chǎn)白花樹生物柴油能源定向培育與制取工藝研究”（2010SY05），浙江省創(chuàng)新團隊建設與人才培養(yǎng)項目（20102F0014）

柳新紅（1967-），男，浙江武義人，研究員，從事森林培育與育種研究。