PEG脅迫對沙冬青種子萌發(fā)過程的影響

段慧榮，李毅，馬彥軍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院，蘭州730070)

在限制植物產(chǎn)量的諸多環(huán)境因子中，以供水條件最為重要，據(jù)統(tǒng)計，全世界由于水分脅迫導致的作物減產(chǎn)，可超過其它因素造成減產(chǎn)的總和。在干旱半干旱地區(qū)，水的短缺始終是制約農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的關鍵因素[1]。在干旱半干旱地區(qū)，通過植樹造林，改善生態(tài)環(huán)境工作已成為當務之急，而木本植物抗旱性研究是該區(qū)造林樹種選擇的基礎，是關系到該區(qū)造林成敗的關鍵因素之一[2]。

種子是植物最重要的繁殖材料，種子萌發(fā)是種子植物生活史中的關鍵階段，也是進行植物抗旱性研究的重要時期[3]。研究表明，在植物生活周期中，植物死亡至少有95%發(fā)生在種子階段[4]。在該階段，土壤水分是影響種子萌發(fā)及幼苗生長的重要生態(tài)因子。發(fā)芽階段的耐旱程度一定程度上反映了該物種的耐旱狀況。種子發(fā)芽狀況也是判定種子質(zhì)量、確定播種量的一項重要指標。近年來，PEG高滲溶液法已經(jīng)成為研究種子萌發(fā)性狀的重要方法，在水稻、小麥等農(nóng)作物上廣泛使用[5]，在牧草上種子抗逆性研究方面也開始逐漸增多[6-7]，而在林木種子的抗逆性研究方面相對比較少[8]。

沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)為亞洲中部荒漠地區(qū)唯一的常綠闊葉灌木，是古老的第三紀孑遺種，也是國家三級保護植物。其抗逆能力極強，但是人工栽培卻極為困難，在保護和開發(fā)利用沙冬青的研究中，探索沙冬青的抗逆機理及其最佳繁殖栽培技術一直是人們關注的焦點。目前，有關沙冬青耐旱性研究已有一些報道，最早見于對其形態(tài)解剖特征的觀察[9]，但是有關沙冬青對PEG滲透脅迫的生理響應研究報道較少?；谝陨险J識，本試驗以PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，研究5種不同PEG濃度(5%～25%)對沙冬青種子萌發(fā)的影響及萌發(fā)幼苗細胞膜透性、可溶性蛋白、丙二醛和脯氨酸含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxide，POD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)等各項生理指標的變化，以期系統(tǒng)了解沙冬青種子萌發(fā)階段的耐旱性特征并揭示其抗旱機理，為沙冬青在干旱區(qū)播種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

沙冬青成熟莢果于2009年8月初采自甘肅省蘭州市九州臺，千粒重為55.1 g。選取健壯飽滿、無損傷和無蟲害的灰黑色種子，用75%的酒精消毒1～2 min后，用自來水和蒸餾水沖洗干凈，浸泡在100℃水5 min后，用蒸餾水沖洗冷卻降溫，放置24 h后進行PEG-6000脅迫處理。

1.2 試驗設計

設質(zhì)量濃度 5%、10%、15%、20%和 25%，對應滲透勢分別為-0.054，-0.177，-0.393，-0.735，-1.25 MPa共5個不同滲透勢濃度的PEG(中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司)溶液，按照李合生[10]的方法配備，對上述沙冬青種子進行干旱脅迫處理。處理采用紙上發(fā)芽，首先在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪2層濾紙，將處理好的種子(大小一致無破損)置于濾紙上，然后加入等量的PEG溶液進行萌發(fā)，以加蒸餾水為對照。每個處理3次重復，每個重復50粒種子，室溫下發(fā)芽，于2009年10月份在甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院實驗室進行。培養(yǎng)過程中每天向培養(yǎng)皿中加入相應處理溶液，保持濾紙濕潤。每3天更換1次濾紙，以防止溶液濃度變動[11]。培養(yǎng)條件為:14 h光照，光照強度2 000 lx，晝溫20～25℃/夜溫15～20℃。

1.3 測定方法

1.3.1 種子發(fā)芽率和死亡率的測定 從種子置床之日起開始觀察，以種子露白為發(fā)芽標準[12]，逐日定時記錄發(fā)芽種子數(shù)，30 d后結束發(fā)芽試驗。參照《種子生物學研究指南》[13]，計算發(fā)芽率和死亡率。其中死亡幼苗以種子萌發(fā)后不再生長甚至腐爛為判斷標準。

發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%

死亡率=死亡苗數(shù)/總苗數(shù)×100%

1.3.2 生理生化指標 在室內(nèi)用電子天平(精度0.1 mg)稱取整株幼苗的鮮重[14]，在80℃烘箱內(nèi)烘干48 h，稱取干重[15]，發(fā)芽結束時自每個處理中分別選取同一生長時期發(fā)育良好的健康植株整株進行生理生化指標的測定，每項實驗重復3次，取平均值。細胞膜透性的測定采用相對電導率法，可溶性蛋白的含量測定采用G-250考馬斯亮藍法，丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法。超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍四唑(NBT)光還原法，以抑制氯化硝基氮藍四唑(NBT)光化還原50%為1個酶活性單位;過氧化物酶(POD)活性用愈創(chuàng)木酚比色法，在470 nm下測定，以每克植物鮮重中每分鐘所含酶活性單位(U)表示;過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用過氧化氫分解法，脯氨酸(Proline)含量的測定采用酸式茚三酮顯色法[14]，顯色后在UV-2450分光光度計520 nm波長處測定光密度值，通過標準曲線計算游離脯氨酸含量。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 16.0軟件進行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 PEG脅迫對沙冬青種子萌發(fā)過程的影響

不同濃度PEG脅迫對沙冬青種子萌發(fā)的影響見圖1。5%和10%PEG濃度下種子發(fā)芽率及萌發(fā)幼苗鮮重與對照無明顯差異，死亡率低。PEG濃度為15%時種子死亡率為3.33%，萌發(fā)幼苗鮮重比對照降低了33.03%，差異顯著(P＜0.05);說明PEG濃度達到 15%時開始抑制種子萌發(fā)生長，并且隨著PEG濃度的升高種子所受到的抑制程度也越高。當PEG濃度達到25%時，萌發(fā)幼苗變得矮小枯黃，鮮重降至0.116 g，極顯著地低于對照(P＜0.01)，發(fā)芽率為2%，死亡率達到98.89%。

2.2 PEG脅迫下沙冬青萌發(fā)幼苗生理指標的變化

2.2.1 相對電導率和丙二醛含量 由圖2可以看出，隨著PEG濃度的增加，沙冬青萌發(fā)幼苗的相對電導率和丙二醛的含量均呈現(xiàn)上升的趨勢。PEG濃度在5%～10%時沙冬青的電導率與對照變化不大，無明顯差異。當濃度達到15%～25%時，電導率呈上升趨勢，并且均與對照有極顯著差異(P＜0.01)。丙二醛含量隨PEG濃度增大而增加，且當濃度達到15%～25%時，各含量均與對照呈極顯著差異(P＜0.01)，分別比對照上升了162.63%、182.36%和188%。

圖1 PEG脅迫對沙冬青種子萌發(fā)過程的影響

圖2 PEG脅迫對沙冬青萌發(fā)幼苗相對電導率和丙二醛含量的影響

2.2.2 可溶性蛋白含量 可溶性蛋白具有較強的親水膠體性質(zhì)，可影響細胞的保水力。隨PEG濃度增大，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。PEG濃度為5%～15%時，含量隨濃度增大而上升，與對照無明顯差異，濃度繼續(xù)增大至20%和25%時開始下降，并分別比對照降低22.37%和32.89%，與對照差異顯著(P＜0.05)，見圖3。

圖3 PEG脅迫對沙冬青萌發(fā)幼苗可溶性蛋白含量的影響

2.3 PEG脅迫對幼苗保護性酶活性的影響

2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性 SOD的主要功能是清除氧自由基，是防止其對細胞膜系統(tǒng)傷害的一種很重要的抗氧化酶。由圖4可見，PEG脅迫對幼苗SOD活性的影響整體表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。其中5%～15%PEG濃度培養(yǎng)下，幼苗SOD活性隨著PEG濃度的增加而增大，分別比對照上升了20.27%、31.38%和65.53%，均與對照呈極顯著差異(P＜0.05)。PEG濃度為20%時活性下降，僅比對照增加了2.86%，無顯著性差異，說明此時抗性減弱。當濃度增加到25%時，酶活性比對照降低了26.27%，與對照呈極顯著差異。

圖4 PEG脅迫對沙冬青萌發(fā)幼苗SOD活性的影響

2.3.2 過氧化物酶(POD)活性 POD在植物體內(nèi)具有廣泛的作用，其主要作用之一是催化H2O2降解。PEG脅迫對沙冬青幼苗POD活性的影響與對SOD活性影響相似，都表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。如圖5所示，PEG濃度為5%時，幼苗POD活性比對照上升了50.96%，與對照有極顯著差異(P＜0.01)。10%PEG濃度下，幼苗的POD酶活性最高，與對照相比上升了76.38%。當PEG濃度達到15%～20%時，幼苗 POD活性開始降低并分別低于對照27.67%、56.32%，其中濃度為15%時與對照差異不顯著。幼苗受到濃度為25%PEG脅迫時POD活性最小，比對照下降了73.48%，與對照差異極顯著。

圖5 PEG脅迫對沙冬青萌發(fā)幼苗POD活性的影響

2.3.3 過氧化氫酶(CAT)活性 圖6表明，各濃度PEG脅迫下CAT酶活性表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢，與對照之間呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)。5%～10%PEG濃度下酶活性呈上升趨勢，分別比對照上升了68.14%和136.38%。當PEG濃度達到15%時，酶的活性開始下降，但仍比對照高出81.06%，濃度為20%～25%時，酶活性比對照分別下降14.23%和63.39%。

圖6 PEG脅迫對沙冬青萌發(fā)幼苗CAT活性的影響

2.4 PEG脅迫對幼苗脯氨酸含量的影響

脯氨酸含量的提高是逆境條件下植物的自衛(wèi)反應之一，細胞脯氨酸含量增加，維持了細胞的膨壓，同時可以保護酶和膜系統(tǒng)免受毒害。由圖7看出，PEG濃度低于20%時，隨濃度的增加沙冬青幼苗的脯氨酸含量升高，說明5%～20%的PEG可以刺激幼苗脯氨酸含量極顯著地上升(P＜0.01)，并分別比對照增加了 164.37%、293.38%、313.7%和 332.03%。當濃度達到25%時，脯氨酸含量迅速下降，并比對照下降了48.57%，與對照之間差異不明顯。

圖7 PEG脅迫對萌發(fā)幼苗脯氨酸含量的影響

3 討論

3.1 PEG脅迫對種子萌發(fā)的影響

用一定濃度的聚乙二醇(PEG)溶液模擬干旱逆境處理種子，使之產(chǎn)生滲透脅迫來研究水分脅迫下種子的生理反應，已有較多報道。種子吸水力與植物的抗旱性呈正相關，吸水力強的種子在干旱脅迫下能夠保持較高的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，而吸水力弱的種子則相反[16]。本試驗中，隨脅迫程度的加深，沙冬青種子發(fā)芽率顯著下降，死亡率呈明顯上升趨勢，鮮重下降。表明隨脅迫程度的加深，沙冬青種子萌發(fā)受到不同程度的抑制，當脅迫超過種子的耐受限度(25%)時將難以萌發(fā)并致死，這與董麗華[17]等的研究結果一致。

3.2 PEG脅迫對萌發(fā)幼苗生理生化指標的影響

細胞膜是植物體內(nèi)部與外部物質(zhì)交換的通道，多種逆境都會使植物細胞膜系統(tǒng)受損，導致膜透性增大，內(nèi)容物滲漏。植物組織外滲液電導率可以表征質(zhì)膜透性的變化并反映脅迫條件下質(zhì)膜受損傷的程度，電導率增幅越大，植物受脅迫損傷程度越重。丙二醛(MDA)是植物在受到傷害時細胞膜發(fā)生膜脂過氧化作用形成的最終分解產(chǎn)物，其含量代表著植物細胞遭受逆境傷害的程度和膜脂過氧化程度[18]。本試驗中，隨脅迫程度的加深，沙冬青萌發(fā)幼苗的電導率不斷上升，同時MDA含量也不斷增加，表明隨脅迫程度加深，萌發(fā)幼苗的膜系統(tǒng)受到不同程度的破壞，膜質(zhì)過氧化作用增大，抗性減弱，這與王宇超等[18]的研究結果一致。

逆境和脅迫會導致植物體內(nèi)大量活性氧的產(chǎn)生，SOD作為重要的活性氧清除酶，能及時清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧將超氧陰離子自由基快速歧化為H2O2和H2O，保護細胞免受傷害[19]。POD和CAT是清除H2O2的重要酶類，能夠分解H2O2為H2O和O2，CAT與超氧化物歧化酶SOD偶聯(lián)，可以徹底清除體內(nèi)超氧陰離子及H2O2等氧自由基，消除逆境對植物的傷害。試驗中隨脅迫程度的加深，SOD、POD和CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這表明在一定范圍(5%～10%)內(nèi)，PEG脅迫能誘導體內(nèi)保護酶活性提高，從而有效地清除活性氧，但嚴重脅迫則會破壞體內(nèi)保護酶系統(tǒng)的活力和平衡，損傷膜的結構并抑制酶的活性。這與左利萍等[20]在檸條葉片的抗氧化酶活性影響的結果一致。

蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者，植物不同其蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量也不同。植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多是參與各種代謝的酶類，在受到干旱脅迫時，它們會發(fā)生一定的變化，測定其含量是了解植物抗逆性的一個重要指標[21]。試驗中，沙冬青萌發(fā)幼苗中可溶性蛋白的含量隨脅迫程度加深先增加后降低，說明通過生成蛋白為抵抗脅迫環(huán)境提供物質(zhì)基礎。研究中，當PEG濃度在20%以上時，可溶性蛋白的含量明顯低于對照，說明此脅迫已超過沙冬青的耐受極限，蛋白質(zhì)水解加快。游離脯氨酸是作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑而起作用的，可以降低細胞水勢和維持膨壓，脯氨酸除了發(fā)揮其本身的滲透、保護作用外，又為新的蛋白質(zhì)的合成提供了氨基，從而促進了與抗旱有關的新蛋白質(zhì)的合成。研究表明，在干旱或其它逆境條件中植物體內(nèi)脯氨酸含量會大量積累。本試驗結果表明，沙冬青萌發(fā)幼苗中脯氨酸含量隨脅迫程度加深先增大后降低，表明脯氨酸作為細胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)劑，在滲透脅迫較輕時可以有效地平衡液泡滲透勢，保護生物大分子不被破壞，作為活性氧的清除劑和抗冷劑抵抗?jié)B透脅迫。脅迫濃度超過25%時，細胞被破壞，導致脯氨酸含量反而降低。

由于本次試驗只是對PEG模擬干旱脅迫下沙冬青種子萌發(fā)進行了研究，認為沙冬青可以適應PEG濃度15%以下的干旱脅迫環(huán)境，至于后期生長過程中的幼苗形態(tài)和生理生化變化，還有待進一步研究和探討。

4 結論

試驗結果表明，沙冬青種子在PEG濃度為5%～10%時能夠萌發(fā)生長，通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如可溶性蛋白和脯氨酸的含量，提高保護性酶SOD、POD與CAT的活性來抵抗脅迫環(huán)境。其能夠忍受PEG濃度15%的干旱脅迫環(huán)境，但已經(jīng)開始出現(xiàn)不適現(xiàn)象，在高濃度(20%和25%)時保護作用被抑制，種子基本不能萌發(fā)，萌發(fā)幼苗矮小枯黃，死亡率上升，抗性下降。

[1] 鄧潔，陳靜，賀康寧.灌水量和灌水時期對冬小麥耗水特性和生理特性的影響[J].水土保持研究，2009，16(2):191-194.

[2] 崔大練，馬玉心，石戈，等.紫穗槐幼苗葉片對不同干旱梯度脅迫的生理生態(tài)響應[J].水土保持研究，2010，17(2):178-185.

[3] 李培英，孫宗玖，阿不來提.PEG模擬干旱脅迫下29份偃麥草種質(zhì)種子萌發(fā)期抗旱性評價[J].中國草地學報，2010，32(1):32-39.

[4] 班勇.植物生活史對策的進化[J].生態(tài)學雜志，1995，14(3):33-39.

[5] 安永平，強愛玲，張媛媛，等.滲透脅迫下水稻種子萌發(fā)特性及抗旱性鑒定指標研究[J].植物遺傳資源學報，2006，7(4):421-426.

[6] 賈國梅，張紅燕，韓京成.土壤含水量對狗牙根葉片生理生態(tài)指標的影響[J].水土保持研究，2009，16(5):199-202.

[7] 左勝鵬，王會梅，李鳳民，等.半干旱區(qū)四種典型豆科牧草群落生理生態(tài)的分異研究[J].水土保持研究，2010，17(1):167-173.

[8] 曾彥軍，王彥榮.幾種旱生灌木種子萌發(fā)對干旱脅迫的響應[J].生態(tài)學報，2002，13(8):953-956.

[9] 張濤.沙冬青生理結構特性的研究[J].林業(yè)科學，1988，24(4):508-509.

[10] 李合生.植物生理生化試驗原理和技術[M].北京:高等教育出版社，2000:260-265.

[11] 宋麗華，周月君.鹽脅迫對臭椿種子發(fā)芽的影響[J].種子，2008，27(9):22-25.

[12] 秦文靜，梁宗鎖.四種豆科牧草萌發(fā)期對干旱脅迫的響應及抗旱性評價[J].草業(yè)學報，2010，19(4):61-70.

[13] 宋松泉，程紅焱，龍春林，等.種子生物學研究指南[M].北京:科學出版社，2000.

[14] 鄭光華.種子生理研究[M].北京:科學出版社，2004:706.

[15] 杜建雄，侯向陽，劉金榮.草地早熟禾對干旱及旱后復水的生理響應研究[J].草業(yè)學報2010，19(2):31-38.

[16] 郭彥軍，倪郁，呂俊，等.豆科牧草種子萌發(fā)特性與其抗旱性差異的研究[J].中國草地，2003，25(3):24-27.

[17] 董麗華，王寧，姚愛興.不同品種早熟禾種子萌發(fā)期抗旱性研究[J].農(nóng)業(yè)科學研究，2005，26(2):6-8.

[18] 王宇超，王得祥，彭少兵，等.干旱脅迫對木本濱藜生理特性的影響[J].林業(yè)科學，2010，46(1):61-67.

[19] 安鈺，沈應柏，張志翔.傷害脅迫對合作楊葉片膜質(zhì)過氧化及抗氧化酶活性的影響[J].水土保持研究，2010，17(5):241-244.

[20] 左利萍，李毅，李朝周.滲透脅迫對檸條葉片脂質(zhì)過氧化及抗氧化酶活性的影響[J].中國草地學報，2009，31(4):69-73.

[21] 史玉煒，王燕凌，李文兵，等.水分脅迫對剛毛檉柳可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量變化的影響[J].新疆農(nóng)業(yè)大學學報，2007，30(2):5-8.