混菌發(fā)酵蘋果渣生產(chǎn)飼料蛋白的研究

謝亞萍，張宗舟，藺海明

（甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，蘭州 730070）

我國是世界最大的蘋果生產(chǎn)國，2004—2007年中國蘋果產(chǎn)量和栽培面積均居世界首位。隨著人們生活水平的提高和觀念的改變，所產(chǎn)蘋果約20%用于生產(chǎn)果汁，榨汁后殘留果渣的重量約為鮮果的25%～35%，如按此計算，我國年產(chǎn)蘋果渣可達120～150萬t。目前，我國僅有25%～30%的蘋果渣用于肥料、燃料、飼料或其他用途，絕大部分因無法進行綜合利用而廢棄，幾天內(nèi)就腐爛變質(zhì)，發(fā)出酸臭味，造成了嚴重的資源浪費和環(huán)境污染[1－6]。蘋果渣中蛋白質(zhì)含量低，但會有大量的果膠質(zhì)、纖維素、半纖維素、維生素和礦物元素等成分[7－10]。但通過太空誘變獲得的微生物發(fā)酵作用可以提高蘋果渣中蛋白質(zhì)含量，降低纖維素、半纖維素和果膠的含量。將蘋果渣轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)飼料，是對蘋果渣有效利用的重要途徑之一，對緩解我國蛋白飼料資源缺乏、提高蘋果種植與加工效益、減少環(huán)境污染具有重要意義[11]。

本研究利用太空誘變獲得的優(yōu)良菌種黑曲霉ZM－8和白地霉以及釀酒酵母、熱帶假絲酵母復配制成混合菌劑，通過微生物固態(tài)發(fā)酵工藝，將果汁生產(chǎn)后產(chǎn)生的蘋果渣轉(zhuǎn)化為蛋白飼料，提高了蘋果渣的蛋白質(zhì)含量及營養(yǎng)價值，既能解決水果榨汁企業(yè)面臨的現(xiàn)實問題，減少環(huán)境污染，又充分利用了資源，為緩解蛋白飼料短缺開辟了一條新途徑，具有重要的經(jīng)濟效益和社會效益以及環(huán)境生態(tài)效益[12－15]。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

黑曲霉突變株ZM－8（Asp.niger ZM－8）保存于PDA斜面培養(yǎng)基[16]。該菌株是由經(jīng)過太空誘變的菌株篩選而得，由本試驗課題組提供。白地霉（Geotrichum candidum）保存于PDA斜面培養(yǎng)基，由天水師范學院微生物院實驗室提供。釀酒酵母（Sac.cerevisiae）和熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）保存于斜面麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，由天水師范學院微生物實驗室提供[17]。

1.2 試驗材料

蘋果渣由禮縣果汁廠提供，麩皮、尿素等為市售。

1.3 培養(yǎng)基

麥麩培養(yǎng)基：將麩皮和水按1:1混合均勻后，裝入250mL的三角瓶，每瓶裝50 g；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：干蘋果渣70 g、麩皮30 g、加自來水110 g混合、拌勻，再加硫銨、白糖、尿素、食鹽。

培養(yǎng)基均在1.0×105Pa，121℃ 滅菌30min，自然pH。

1.4 發(fā)酵工藝

1.5 試驗方法

以蘋果渣70 g、麥麩30 g，并加水110 g，拌勻。將原料放置蒸煮鍋中蒸30min，并依次加入硫銨、白糖、尿素和食鹽等營養(yǎng)物質(zhì)。

將三角瓶麩皮培養(yǎng)基固體擴大得到的太空誘變菌種黑曲霉ZM－8和白地霉以及用麥芽汁液體搖瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的熱帶假絲酵母、釀酒酵母按照不同比例混合制成太空復合菌劑。再將制成的太空復合菌劑于30℃下接種到蒸煮好的原料中，拌勻。

接種含有太空誘變復合菌劑之后，堆制24 h（堆溫不要超過36℃），期間不斷攪拌，24 h后原料上長滿菌絲體，顏色為灰白色。將原料移入發(fā)酵池中，通風培養(yǎng)（溫度不要超過36℃），48 h后培養(yǎng)結(jié)束。

將培養(yǎng)好的半成品從發(fā)酵池中移出，運進烘干室進行烘干。烘干溫度為100℃，時間控制在3 h以內(nèi)，水分控制在5%～7%為宜。烘干后降溫、粉碎，進行質(zhì)檢。

1.6 測定指標

粗蛋白的測定采用GB/T 6434－94凱氏定氮法。

1.7 發(fā)酵條件的研究

1.7.1 培養(yǎng)基配方中各營養(yǎng)元素含量的確定

在單因素試驗的基礎上，以培養(yǎng)基中各營養(yǎng)成分硫銨、白糖、尿素、食鹽為考察因素，采用L9（34）設計方案，因素水平見表1。自然pH發(fā)酵，低溫烘干后測定粗蛋白[11]。

表1 試驗因素水平g

1.7.2 多菌復配適宜配比的確定

在單因素試驗的基礎上，以培養(yǎng)基中黑曲霉ZM－8、釀酒酵母、白地霉和熱帶假絲酵母為考察因素，選用4因素3水平L9（34）正交表，設計正交試驗，在自然pH發(fā)酵，低溫烘干后分析粗蛋白含量，見表2。

表2 試驗因素水平g

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用DPS軟件對測定的數(shù)據(jù)進行4因素3水平正交試驗極差分析。

2 結(jié)果分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方對產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響

不同培養(yǎng)基配方對產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響見表3。

表3 優(yōu)化發(fā)酵條件的L9（34）正交試驗結(jié)果

由表3可知，尿素對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響最大，其次是硫銨，再是食鹽，最后是白糖；最優(yōu)水平組合為：C2A2D2B1，即硫銨7 g、白糖4 g、尿素2 g、食鹽4 g，在確定的優(yōu)化條件下發(fā)酵蘋果渣，產(chǎn)物中粗蛋白含量可達26.4%。

2.2 多菌復配不同配比對產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響

多菌復配不同配比對產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響見表4。

由表4可知，黑曲霉突變株ZM－8對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響最大，其次是熱帶假絲酵母，再是白地霉，最后是釀酒酵母；最優(yōu)水平組合為A1D3C2B3，即黑曲霉突變株ZM－8 0.5 g、釀酒酵母1.5 g、白地霉1.0 g、熱帶假絲酵母1.5 g，在確定的較優(yōu)條件下發(fā)酵蘋果渣，產(chǎn)物中粗蛋白含量可達27.9%。

表4 蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白的L9（34）正交試驗結(jié)果

3 討 論

由正交試驗結(jié)果可知，蛋白質(zhì)含量明顯提高。菌體蛋白飼料中的粗蛋白可能來自3個方面：菌種本身含有的蛋白質(zhì)、發(fā)酵基礎物中存在的蛋白質(zhì)以及轉(zhuǎn)化而來的蛋白質(zhì)。用混菌發(fā)酵是利用各菌之間的協(xié)同作用，提高發(fā)酵效益，產(chǎn)品有較強的果香味和酒香。任克寧等采用糞鏈球菌和啤酒酵母混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)蘋果渣生物飼料，結(jié)果表明，最佳工藝條件為發(fā)酵溫度28℃，混菌菌株接種比例1∶1.2，發(fā)酵時間5 d，其發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量為13.51%，活酵母菌數(shù)23.27億個·g－1，產(chǎn)品有芳香氣味，適口性較發(fā)酵前有較大改觀，具有蛋白飼料和微生態(tài)制劑的雙重特性[18]。試驗中各因素對粗蛋白含量的影響各不相同，但從生產(chǎn)成本和飼料的安全性出發(fā)，本試驗的優(yōu)化條件是可行的。由于研究條件的限制，對發(fā)酵后的果渣蛋白飼料未做動物飼養(yǎng)試驗，其營養(yǎng)成分的可消化率無法詳細測定。

4 結(jié) 論

通過正交試驗獲得了蘋果渣發(fā)酵的適宜的培養(yǎng)基配方，即硫銨7 g、白糖4 g、尿素2 g、食鹽4 g、可使產(chǎn)物中粗蛋白的含量達26.4%。利用太空誘變獲得的優(yōu)良菌種黑曲霉ZM－8和白地霉以及釀酒酵母、熱帶假絲酵母復配制成的混合菌劑，用于蘋果渣的發(fā)酵，可以獲得蛋白質(zhì)含量較高的菌體蛋白，粗蛋白含量提高了335.94%?；旌暇鷦┑淖顑?yōu)配比為黑曲霉突變株ZM－8 0.5 g、釀酒酵母1.5 g、白地霉1.0 g、熱帶假絲酵母1.5 g。

[1]籍保平,尤希風,張博潤.蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的工藝條件[J].生物工程進展,1999（5）:26－28.

[2]楊福有,祁周約,李彩鳳,等.陜西蘋果渣生產(chǎn)利用現(xiàn)狀調(diào)查[J].陜西農(nóng)業(yè)科學,1999（4）:29－30.

[3]高再興,陳五嶺,段東霞,等.微生物發(fā)酵果渣蛋白飼料Ⅱ發(fā)酵工藝的研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版）,2003（6）:701－704.

[4]孫中濤.蘋果渣與棉粕固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)NSP酶的研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學,2008.

[5]李志西.蘋果渣資源化利用研究與實踐[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學,2007.

[6]劉勇,龔月生,劉林麗.蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白質(zhì)飼料的研究[J].中國飼料,2006（13）:38－40.

[7]陳懿.混菌種發(fā)酵蘋果渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料的研究[J].貴州工業(yè)大學學報（自然科學版）,2006,35（5）:19－24.

[8]羅雯.蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究[J].科學技術(shù)與工程,2004,4（5）:371－379.

[9]李巨秀,李志西,黃海瀛.蘋果渣生產(chǎn)菌體蛋白質(zhì)飼料發(fā)酵條件的研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版）,2003,31:79－81.

[10]司翔宇,李志西,葛蕾,等.蘋果渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2005（3）:98－100.

[11]常顯波,薛泉宏,來航線,等.鮮蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版）,2004（1）:40－46.

[12]馬旭光,藺海明,張宗舟,等.黑曲霉高產(chǎn)纖維素酶活突變株ZM－8的篩選[J].中國飼料,2007（5）:30－32.

[13]徐抗震,宋紀蓉,黃潔,等.蘋果渣混合菌發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的研究[J].飼料工業(yè),2003（07）:35－37.

[14]武運,李煥榮,陶詠霞,等.發(fā)酵蘋果渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料工藝的研究[J].中國釀造,2009（1）:83－85.

[15]徐抗震,宋紀蓉,趙宏安,等.蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的菌種選育[J].西北大學學報（自然科學版）,2003,33（2）:167－170.

[16]林夢藻.微生物學[M].長春:東北師范大學出版社,1997.

[17]蓋鈞鎰.試驗統(tǒng)計方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999.

[18]任克寧,張福元,牛嵐,等.混菌固態(tài)發(fā)酵蘋果渣生產(chǎn)生物飼料的研究[J].飼料博覽,2010（2）:1－4.