萊蕪豬GPx4基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律研究

陳 偉,杜金芳,崔景香,陳其美,胡艷霞,楊 倫,曾勇慶

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東泰安 271018)

磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,GPx4)是哺乳動物體內(nèi)廣泛分布的多功能硒蛋白[1],不但參與細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng),保護(hù)生物膜系統(tǒng)免受氧化損傷[2],而且還在細(xì)胞凋亡中起作用[3]。人(GenBank登錄號:NM_002085)、褐家鼠(GenBank登錄號:NM_017165)、豬(GenBank登錄號:NM_214407)等物種的GPx4基因的cDNA已被克隆出來。在不同的物種中GPx4基因結(jié)構(gòu)有所不同,豬GPx4基因的DNA序列包括7個外顯子,6個內(nèi)含子。并且該基因的3′-UTR可以形成頸環(huán)結(jié)構(gòu),5′-UT R和第1內(nèi)含子中含有參與激素調(diào)控的多種元件[4]。目前,對于GPx4基因表達(dá)規(guī)律的研究主要集中在靈長類動物[5],結(jié)果表明,GPx4基因是在組織特異調(diào)控下表達(dá)的。

萊蕪豬是我國優(yōu)良地方豬種黃淮海黑豬的一個類群,研究表明萊蕪豬不但具有肉味香濃、肉質(zhì)細(xì)嫩、系水力強(qiáng)等優(yōu)良種質(zhì)特性[6,7],而且還具有良好的抗氧化能力,如肌肉SOD活性顯著高于大白豬[6]。已有的研究結(jié)果表明:肌肉中GPx4基因的表達(dá)量在很大程度上影響豬肉品質(zhì)的系水力和抗氧化能力[8]。本研究擬從mRNA水平,研究GPx4基因在萊蕪豬不同組織中的表達(dá)差異,為進(jìn)一步探索GPx4基因的遺傳效應(yīng)和肉質(zhì)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ),希望能夠?yàn)榻沂綠Px4基因在地方豬種中的表達(dá)特性,以及GPx4對豬抗氧化性能的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

萊蕪豬去勢成年公豬5頭,平均體重100±5 kg,由萊蕪市畜牧獸醫(yī)局提供。頸靜脈放血致死,取腦、心、肝、脾、肺、背最長肌、背膘、大腸、小腸和脊髓 10種組織,立即放入 DEPC水處理過的 EP管,并迅速置于液氮中保存,實(shí)驗(yàn)室-70℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總 RNA的提取 按照 TRIZOL?Reagent試劑盒操作說明分別提取5頭豬不同組織的總RNA。用DNase I(Fermentas)處理總RNA,去除基因組污染。紫外分光光度計(jì)測定總RNA的濃度,調(diào)整濃度至1 μ g/μ L,并用1%瓊脂糖膠電泳檢測總RNA的完整性。提取的各組織的總RNA于-70℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank上公布的豬GPx4(NM_214407)的mRNA序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,正向、反向引物位于不同的外顯子中以消除基因組DNA對RT-PCR的影響。內(nèi)參基因β-actin的引物序列參照McBryan等[9]人所公布的序列。兩對引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物詳細(xì)信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3 cDNA合成

反轉(zhuǎn)錄在20 μ L體系中進(jìn)行:500 ng引物Oligo-d(T)18和0.5 μ L dNT Ps(2.5 mmol/L)的混合物65℃反應(yīng) 5 min,冰上冷卻至少 1 min,再加5μ L DT T(0.1 mol/L),4 μ L 5×First-Strand Buffer,40 U RNA酶抑制劑(Promega公司)和200 U反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司),50℃孵育60 min；產(chǎn)物cDNA-20℃保存?zhèn)溆?。用無反轉(zhuǎn)錄酶對照進(jìn)行檢測基因組污染。cDNA用水1:20稀釋后用于熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.4 RT-PCR檢測

以萊蕪豬不同組織 cDNA為模板,25 μ L反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 2.5 μ L,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μ L,Mg2+(25 mmol/L)1.5 μ L,正反向引物 (10 μ mol/L)各 0.5 μ L,rTaq DNA 聚合酶 (5 U/μ L)0.5 μ L,cDNA 模板1 μ L,ddH2O 16.5 μ L,反應(yīng)程序:94℃5 min；94℃30 s,58℃30 s,72 ℃30 s,35個循環(huán)；72℃10 min,產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:從每種組織的cDNA中各取10 μ L進(jìn)行混池,倍比稀釋8個梯度,在Mx3000PTM(Stratagene,USA)儀器中進(jìn)行熒光定量反應(yīng),獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和熔解曲線,分析所得結(jié)果。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測:根據(jù)SYBR Permix Ex TaqTM(TaKaRa公司)試劑盒建議的反應(yīng)條件構(gòu)建15 μ L 反應(yīng)體系 :SYBR Permix Ex TaqTM7.5 μ L,ROX Reference Dye II 0.3 μ L,上下游引物 (10 μ mol/L)各0.3 μ L,cDNA 模板 5 μ L,ddH2O 補(bǔ)至總體積15 μ L。反應(yīng)程序:95℃ 15 s；95℃ 10 s,58℃20 s,72℃20 s,40個循環(huán)；95℃1 min,60℃30 s,95℃30 s,1個循環(huán)。同時(shí),每個樣本設(shè)無模板對照。定量循環(huán)數(shù)(Quantification cycle,Cq)小于35時(shí)可以被用于計(jì)算相對表達(dá)量,每個樣本重復(fù)3次,取其平均值計(jì)算定量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用2-ΔΔCT方法計(jì)算各組織中GPx4基因的相對表達(dá)量[10]。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS(9.2)軟件的GLM程序進(jìn)行方差分析,各組織中GPx4表達(dá)量差異的顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測

從各種組織提取的總RNA通過核酸紫外分光光度計(jì)檢測其濃度,結(jié)果各組織樣本的A260/A280均介于1.8～2.0之間。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果:28S、18S條帶清晰,達(dá)到反轉(zhuǎn)錄要求。反轉(zhuǎn)錄后,以各組織的cDNA為模板進(jìn)行GPx4基因的RT-PCR反應(yīng),PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,10種組織均檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。結(jié)果表明10種組織的cDNA均可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

圖1 萊蕪豬不同組織中GPx4基因檢測Fig.1 PCR products of GPx4 gene from different tissues of Laiwu pigs

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

內(nèi)參基因β-actin、目的基因GPx4的熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖2-A、B。由圖2可知,各點(diǎn)分別代表β-actin、GPx4基因的混池cDNA在8個濃度梯度擴(kuò)增的拷貝數(shù),熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù)R2在0.99以上,擴(kuò)增效率在95%～105%之間,說明結(jié)果具有很好的可靠性。

圖2 β-actin(A)、GPx4(B)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of β-actin(A)and GPx4(B)gene

圖3為β-actin、GPx4基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線。從擴(kuò)增動力學(xué)曲線可以看出,目的基因(圖3-A)和內(nèi)參基因(圖3-B)平行性較好,拐點(diǎn)清楚,基線平穩(wěn)；而且β-actin、GPx4基因的熔解曲線(圖3-C)符合基因熔解標(biāo)準(zhǔn),熒光定量PCR產(chǎn)物只有1個峰,說明該P(yáng)CR反應(yīng)是特異性的,無引物二聚體及非特異性擴(kuò)增,滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 GPx4、β-actin基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.3 Amplification plots,dissociation curves for β-actin and GPx4 gene

2.3 不同組織中GPx4基因的相對表達(dá)量

萊蕪豬GPx4基因在不同組織中的相對表達(dá)量見圖4。經(jīng)內(nèi)參基因β-actin對萊蕪豬不同組織GPx4表達(dá)量的校正,GPx4基因在萊蕪豬腦、心、肝、脾中mRNA表達(dá)水平極顯著高于其他組織(P＜0.01)。其中,在肌肉中的表達(dá)量顯著高于脊髓、大腸、背膘和小腸的表達(dá)量(P＜0.05)；在肺中的相對表達(dá)量最低,差異顯著(P＜0.05)。綜上,GPx4在萊蕪豬10種組織中表達(dá)量差異變化明顯趨勢為:腦、心、肝、脾＞肌肉＞脊髓、大腸、背膘、小腸＞肺。

圖4 萊蕪豬不同組織中GPx4基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of GPx4 gene in different tissues of Laiwu pigs

3 討論

需氧生物在氧化循環(huán)過程中會產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基、過氧化氫等活性氧。過多的自由基將導(dǎo)致一系列氧化損傷,如DNA損傷、脂質(zhì)氧化等[11]。生物體在長期的進(jìn)化過程中,形成了一套完整的抗氧化防御體系:非酶類和酶類抗氧化系統(tǒng)。其中,酶類抗氧化劑主要包括超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)。

GPx家族中的GPx4是機(jī)體內(nèi)酶類抗氧化系統(tǒng)中的重要成員,在不同組織還發(fā)揮重要的抗氧化功能。GPx4由Ursini及其合作者在1982年首次從豬肝臟中分離純化得到[12],并在1985年描述為“過氧化物抑制蛋白”[13]。GPx4是分子量在20～22 kDa的單體蛋白,不同于GPx家族其他成員的四聚體結(jié)構(gòu)[1]。GPx4是哺乳動物細(xì)胞中唯一能直接還原生物膜上的磷脂氫過氧化物,保護(hù)生物膜免受氧化應(yīng)激損傷[14]。Lei等人報(bào)道,GPx4在大鼠睪丸內(nèi)活性最高,是肝臟的15倍,是心臟和肺臟的25倍[15]。

Fukuhara等人研究靈長類動物的谷胱甘肽同工酶時(shí)發(fā)現(xiàn):GPx4 mRNA在精巢中高豐度表達(dá),在其他組織(如心、肺等)中表達(dá)量較少[5]。在其他動物不同組織中GPx4 mRNA的表達(dá)規(guī)律基本一致,如小鼠、山羊的GPx4 mRNA在不同組織中的表達(dá)規(guī)律為:心、腦、肝＞肺＞背最長肌[16,17]。本研究中萊蕪豬GPx4 mRNA在不同組織中的表達(dá)趨勢與上述規(guī)律基本一致。心、腦對氧化應(yīng)激敏感,因此,GPx4 mRNA的高豐度表達(dá)可能對保護(hù)心臟和大腦組織免受氧化應(yīng)激損傷起重要作用。背膘組織中高濃度的多不飽和脂肪酸容易引起脂質(zhì)氧化,所以在背膘組織中GPx4 mRNA的相對高豐度表達(dá)起到更好的抗氧化作用。我們的研究結(jié)果提示:GPx4基因在萊蕪豬不同組織中廣泛分布,但是表達(dá)量差異很大；豬GPx4基因在不同組織中參與調(diào)控抗氧化方面發(fā)揮重要作用,造成這種差異表達(dá)的原因還需要更深入的研究以闡明這種機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測GPx4基因mRNA在萊蕪豬不同組織中的表達(dá)規(guī)律,結(jié)果表明:GPx4 mRNA在心、腦等易暴露于ROS和自由基造成氧化應(yīng)激環(huán)境的組織中高豐度表達(dá),并且顯著高于肌肉、脊髓、大腸、背膘、小腸等其它組織中GPx4 mRNA的表達(dá)量。在所檢測的10種組織中,肺中的GPx4 mRNA表達(dá)量最低。

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