馬來(lái)酸甲基麥角新堿注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法建立的方法學(xué)研究

李 斌，李俊卿

(1.濱州市食品藥品監(jiān)督管理局濱城區(qū)分局，山東 濱州 256618;2.東營(yíng)市藥品檢驗(yàn)所，山東 東營(yíng) 257091)

馬來(lái)酸甲基麥角新堿注射液為子宮收縮藥，臨床用于肌注或靜脈滴注，因此控制其細(xì)菌內(nèi)毒素含量對(duì)于藥品的安全性非常關(guān)鍵。為了更好地控制藥品質(zhì)量，筆者參照《中國(guó)藥典》2010年版(二部)中“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，通過研究，我們建立了本品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ZH－2 BLENDER混勻器;TAL－40型恒溫器(天津藥典儀器廠);無(wú)熱原吸頭，微量移液器。

1.2 試藥 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(福州新北生化工業(yè)有限公司，效價(jià)10 EU/支，批號(hào)080524);鱟試劑(TAL，靈敏度0.25 EU·mL－1，批號(hào)0906242，湛江安度斯生物有限公司);鱟試劑(TAL，靈敏度 0.25 EU·mL－1，批號(hào) 08061012，福州新北生化工業(yè)有限公司);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(批號(hào)08060605，福州新北生化工業(yè)有限公司 規(guī)格:5 mL/支);馬來(lái)酸甲基麥角新堿注射液馬來(lái)酸甲基麥角新堿注射液(濰坊中獅制藥有限公司;批號(hào):090401、090402、090403;規(guī)格:1 mL∶0.2 mg)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度(λ)復(fù)核 按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成 2.0、1.0、0.5、0.25 λ 4個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，靈敏度為0.25 EU·mL－1的兩批鱟試劑符合規(guī)定，見表1。結(jié)果顯示:鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc)在 0.5～2 λ 之間(包括 0.5λ 和 2λ)，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以表示靈敏度0.25 EU·mL－1作為鱟試劑的靈敏度。

2.2 馬來(lái)酸甲基麥角新堿注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定 藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)一般按以下公式確定:L=K/M，式中K為按照規(guī)定的給藥途徑，人用每千克體重每1 h可接受的內(nèi)毒素最大劑量，注射劑的K=5 EU·(kg·h)－1;M為人用每千克體重每1 h給藥的最大供試品劑量，經(jīng)過查閱本品說(shuō)明書，本品的最大給藥量為0.2 mg，按照我國(guó)人均體重 60 kg 計(jì)算，M=3.33 μg·(kg·h)－1，因此細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值為:L=K/M=5/3.33=1.5 EU·μg－1。

2.3 供試品的最小有效稀釋濃度(MVC) 目前市售的鱟試劑靈敏度(λ)通常在 0.5～0.03 EU·mL－1之間，因此，有效稀釋濃度為 0.002～ 0.333 μg·mL－1之間。選用靈敏度為0.25 EU·mL－1鱟試劑時(shí)，供試品的最大有效稀釋濃度C=λ/L=0.25/1.5=0.1667 μg·mL－1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

2.4 供試品干擾初篩試驗(yàn) 用BET水將馬來(lái)酸甲基麥角新堿注射液(批號(hào) 090401)分別稀釋成原液、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195 μg·mL－1系列濃度，每一稀釋濃度供試品做2支供試品管和2支供試品陽(yáng)性對(duì)照(即用該濃度的供試品稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2.0λ濃度的內(nèi)毒素溶液)，與鱟試劑混合進(jìn)行抑制/增強(qiáng)試驗(yàn)，結(jié)果表明，供試品在較高濃度時(shí)對(duì)鱟試劑有干擾作用。在供試品至少稀釋至濃度為12.5 ug·mL－1后則對(duì)鱟試劑無(wú)干擾作用，見表2。

表2 干擾試驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 供試品干擾試驗(yàn) 由干擾初篩試驗(yàn)可知，選擇靈敏度0.25 EU·mL－1的TAL，用BET水將3批供試品稀釋至濃度為12.5 ug·mL－1后進(jìn)行干擾試驗(yàn)。具體操作步驟如下:每個(gè)鱟試劑取18支做內(nèi)毒素水溶液系列反應(yīng)，即用0.1 mL BET 水復(fù)溶，再分別加已制備的 0.5，0.25，0.125，0.06 EU·mL－1內(nèi)毒素溶液0.1 mL，每一濃度內(nèi)毒素4支反應(yīng)管，水溶液陰性對(duì)照(NC)2支反應(yīng)管;另取54支分3組，每組18支做內(nèi)毒素供試品溶液系列反應(yīng)，即用0.1 mL BET水復(fù)溶，再分別加已制備的含 0.5，0.25，0.125，0.06 EU·mL－1內(nèi)毒素的濃度為 12.5 μg·mL－1的供試品溶液 0.1 mL，每一濃度內(nèi)毒素4支反應(yīng)管，供試品陰性對(duì)照(NPC)2支反應(yīng)管。不同廠家的鱟試劑各做一份，具體結(jié)果見表3，Et均在0.5～2.0 Es范圍內(nèi)，說(shuō)明供試品稀釋至濃度為12.5 μg·mL－1后確已排除干擾作用，在低于或等于此濃度的情況下即可使用內(nèi)毒素檢查法。

2.6 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 采用鱟試劑(TAL，靈敏度0.25 EU·mL－1，批號(hào)0906242，湛江安度斯生物有限公司)，按照《中國(guó)藥典》附錄XI E對(duì)供試品(批號(hào):090401090402090403)進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，結(jié)果3批供試品每μg馬來(lái)酸麥角新堿含內(nèi)毒素的量均小于1.5 EU。

表3 干擾試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 通過實(shí)驗(yàn)表明，本法可用馬來(lái)酸甲基麥角新堿注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，檢查時(shí)只要將其至少稀釋至濃度為12.5 μg·mL－1，在低于或等于此濃度的情況下，選擇相應(yīng)靈敏度的鱟試劑即可進(jìn)行本品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

3.2 不同鱟試劑對(duì)供試品的反應(yīng)有差異。本實(shí)驗(yàn)采用兩種不同批號(hào)的鱟試劑同時(shí)進(jìn)行干擾試驗(yàn)，得到了較為滿意結(jié)果。