魚腥草對(duì)半滑舌鰨非特異免疫活性的影響

集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 劉金海 鄭志斌 張 偉 譚大明

半滑舌鰨屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，俗稱“龍脷”、牛舌頭、鰨目、鰨板、鰙鰨、細(xì)鱗、鰨米等，為名貴海水魚類，主要分布于我國(guó)的渤海、黃海海域，是一種暖溫性底棲大型魚類，生長(zhǎng)速度快，肉味鮮美，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高（徐永江等，2005；姜言偉和萬景瑞，1998；Engstad 等，1992）。 近年來，魚腥草對(duì)小鼠、大鼠及人類的抗菌、免疫研究成果報(bào)道較多，但其對(duì)魚類非特異免疫能力影響的報(bào)道較少。基于魚腥草對(duì)小鼠、大鼠及人類具有良好免疫活性及半滑舌鰨病害頻發(fā)的現(xiàn)狀，本文初步開展了魚腥草對(duì)半滑舌鰨非特異免疫活性影響的研究，為合理配制半滑舌鰨免疫促生長(zhǎng)餌料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚 半滑舌鰨活魚（93.78±2.97）g

1.1.2 試劑及藥品 魚腥草（購(gòu)于廈門市集美區(qū)石鼓路大藥房），肝素鈉、KH2PO4、甲醛、NaOH 溶液（0.5 mol/L）（國(guó)際集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），Na3PO4（宜興市第二化學(xué)試劑廠），姬姆薩染料（上海晶天生物科技有限公司），甘油（福建省廈門向陽醫(yī)藥化工廠），甲醇（上海化學(xué)試劑總廠），乙醇（75%）（廣東光華化學(xué)廠有限公司），高錳酸鉀（蕪湖市輝隆中信化工有限公司），牛肉膏、蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），瓊脂、NaCl（廣東省汕頭市西隴化工廠），所用試劑均為AR級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備 醫(yī)用型凈化工作臺(tái)（SW-CJZFD）、生物培養(yǎng)箱（LRH-250-G）、顯微鏡（Leica DF40）、可見分光光度計(jì)（V1100）、高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-SII）、離心機(jī)（TGL-16C）、電子天平（BS110S）、雙螺桿制粒機(jī)（CD4 × 1TS多功能催化劑成形機(jī)）、電爐、接種環(huán)、酒精燈、試管、棉塞、培養(yǎng)皿、錐形瓶、量筒、玻璃棒、精密pH試紙、2 mL針管、解剖盤、血球計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、載玻片、蓋玻片。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)用魚養(yǎng)殖管理 試驗(yàn)用水族箱（長(zhǎng)60 cm、寬40 cm、高40 cm）10個(gè)，均具有自動(dòng)控溫、充氧及水循環(huán)過濾裝置。每箱放15尾半滑舌鰨暫養(yǎng)，每晚18∶00和22∶00各投喂基礎(chǔ)餌料一次。15 d后，測(cè)定其免疫指標(biāo)作為底值。之后投喂免疫餌料，每10 d測(cè)免疫指標(biāo)一次，共測(cè)3次。

1.3.2 基礎(chǔ)餌料配方與制備 先將魚粉、沙蠶粉、豆粉、淀粉、礦物鹽、酵母粉和預(yù)混料等粉狀成分按所需用量混合均勻，再將攪碎的牡蠣肉、魚油與粉狀料混勻，最后制粒備用?；A(chǔ)餌料組成見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料配方 %

1.3.3 試驗(yàn)飼料的配制 免疫餌料配方見表2。按照該配方表配制免疫餌料。稱取20、40、60 g魚腥草，分別加適量水熬制濃縮，熬制3次并分別合并濃縮液。將所得3種濃縮液（1#、2#、3#）分別與基礎(chǔ)餌料混勻，制成3種免疫餌料，晾干備用。

表2 試驗(yàn)餌料配方（每100 g含量）

1.3.4 培養(yǎng)基的配制 使用002營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基配方，參照沈萍等（1999）方法配制。血清溶菌酶活性的測(cè)定、吞噬能力的測(cè)定、免疫器官（脾臟）指數(shù)測(cè)定參照劉金海等（2010）方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 魚腥草對(duì)半滑舌鰨溶菌酶活性的影響 對(duì)照組溶菌酶活性在 0、10、20、30 d時(shí)均無顯著變化（P＞0.05）。試驗(yàn)開始10 d后，各試驗(yàn)組溶菌酶活性均顯著高于對(duì)照組（基礎(chǔ)餌料組），隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組溶菌酶活性顯著性升高（P＜0.05）。30 d時(shí)，試驗(yàn)組3的溶菌酶活性最高（見表3）。

表3 半滑舌鰨溶菌酶活性

2.2 魚腥草對(duì)半滑舌鰨白細(xì)胞吞噬活性的影響對(duì)照組白細(xì)胞吞噬活性（吞噬百分比和吞噬指數(shù)），在 0、10、20、30 d 時(shí)變化不大。 試驗(yàn)開始 10 d后，各試驗(yàn)組白細(xì)胞吞噬活性均高于對(duì)照組（基礎(chǔ)餌料組），各試驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)上白細(xì)胞吞噬活性較對(duì)照組均存在顯著性差異（P＜0.05）；除0d外，其余各時(shí)間點(diǎn)，隨魚腥草添加劑量增多，試驗(yàn)組1、2、3 的白細(xì)胞吞噬活性依次增強(qiáng)（P ＜ 0.05）。30d時(shí)，試驗(yàn)組3的白細(xì)胞吞噬活性最高（見表4、5）。

表4 半滑舌鰨吞噬細(xì)胞的吞噬百分比

表5 半滑舌鰨吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)

2.3 魚腥草對(duì)半滑舌鰨免疫器官（脾臟）指數(shù)的影響 見表6。試驗(yàn)組與對(duì)照組之間、各試驗(yàn)組之間脾臟指數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。

表6 半滑舌鰨脾臟免疫指數(shù)

3 討論

3.1 魚腥草對(duì)半滑舌鰨溶菌酶活性的影響 溶菌酶活性是評(píng)價(jià)魚類免疫力的常用指標(biāo)之一（黃洪敏等，2005）。溶菌酶是由淋巴細(xì)胞分泌的堿性溶解酶，當(dāng)機(jī)體受到病原攻擊時(shí)，白細(xì)胞聚集在感染區(qū)，包圍異物進(jìn)行吞噬，此時(shí)吞噬細(xì)胞活性增強(qiáng)，吞噬細(xì)胞中含有溶菌酶，因此隨著吞噬活性的增強(qiáng)也導(dǎo)致了溶菌酶活性的變化（張耀武等，2008）。應(yīng)惠芳（2006）研究表明，艾葉和鮮魚腥草對(duì)金葡球菌、白葡球菌及傷寒桿菌有較強(qiáng)的抗菌作用。袁呂江等（2005）發(fā)現(xiàn)，魚腥草素同系物能夠提高小鼠血清溶菌酶活力，且隨濃度增加增幅加大，最大可達(dá)20%。體外試驗(yàn)時(shí)，在低濃度時(shí)魚腥草素同系物明顯提高溶菌酶的活性，超過一定濃度時(shí)則表現(xiàn)出抑制溶菌酶的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，投喂添加魚腥草熬制濃縮液的免疫餌料，可以提高半滑舌鰨溶菌酶活性，在一定劑量?jī)?nèi)，隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)和魚腥草劑量增加而升高。

3.2 魚腥草對(duì)半滑舌鰨吞噬活性的影響 眾多的研究表明，魚腥草可以增加試驗(yàn)動(dòng)物的特異性或非特異性免疫能力。任翠玉等（1998）用X-射線照射每只口服魚腥草營(yíng)養(yǎng)液0.4 mL/d的小鼠及對(duì)照組1個(gè)月后，口服魚腥草營(yíng)養(yǎng)液的小鼠血清溶血素含量、巨噬細(xì)胞吞噬百分率指數(shù)明顯高于對(duì)照組。魚腥草注射液可增加中性粒細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光值，而對(duì)單核細(xì)胞無顯著影響，表明魚腥草注射液可能參與調(diào)整中性粒細(xì)胞氧化過程（呼吸爆發(fā)），并增加中性粒細(xì)胞的殺菌能力（王潮臨等，1997）。合成魚腥草素可以刺激巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)，提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度水平，促進(jìn)T細(xì)胞分泌IL-2，說明魚腥草素可能局域激活巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的作用（Wang等，2002）。另有研究表明，魚腥草素提高細(xì)胞免疫能力可能是由于它靠疏水吸附作用與免疫細(xì)胞結(jié)合而發(fā)生作用；魚腥草素同系物在巨噬細(xì)胞上吸附后，通過某種途徑對(duì)巨噬細(xì)胞的酶系發(fā)生激活作用，從而提高了動(dòng)物的免疫功能。且有試驗(yàn)表明，延長(zhǎng)魚腥草素碳鏈的長(zhǎng)度有助于尋找到有高免疫促進(jìn)作用的新型魚腥草素衍生物（袁呂江等，2004）。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)期間投喂添加魚腥草熬制濃縮液的免疫餌料，可明顯提高半滑舌鰨白細(xì)胞的吞噬活性，隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)和魚腥草量的增加而增強(qiáng)，這與上述許多研究結(jié)果相一致。

3.3 魚腥草對(duì)半滑舌鰨免疫器官（脾臟）指數(shù)的影響 硬骨魚類的脾臟在造血和免疫反應(yīng)方面都起著重要的作用。脾臟是紅細(xì)胞、中性白細(xì)胞和粒細(xì)胞生成、貯存與成熟的主要器官。其重量變化與機(jī)體免疫狀況變化密切相關(guān)（葛立安等，2008）。但喬志剛等（2008）分析認(rèn)為，魚類的免疫器官重量相對(duì)較小，其增加或減少反映到免疫器官指數(shù)上變化不顯著。袁呂江等（2004）研究表明，隨著魚腥草素同系物碳原子數(shù)增加，對(duì)受試小鼠免疫器官重量無影響。本免疫試驗(yàn)設(shè)計(jì)為30 d，半滑舌鰨免疫器官（脾臟）指數(shù)不隨魚腥草添加劑變化而變化，本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

（1）試驗(yàn)組半滑舌鰨溶菌酶活性和白細(xì)胞吞噬活性均高于對(duì)照組，且隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而增高，隨魚腥草添加劑量增多而增強(qiáng)。

（2）魚腥草添加劑量對(duì)半滑舌鰨免疫器官（脾臟）指數(shù)影響不顯著（P＞0.05）。

（3）以60 g魚腥草熬制的濃縮液為添加劑制成的試驗(yàn)餌料，對(duì)增強(qiáng)半滑舌鰨非特異免疫活性效果較好。

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