酶解輔助乙醇法提取土茯苓總黃酮條件研究

任倩 李志平* 楊朝霞 朱曉妮

（吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 湖南吉首 416000）

土茯苓為百合科植物光葉菝葜的干燥根莖，主要產(chǎn)于華中、華南地區(qū)。味甘、淡，性平，具有解毒散結(jié)、祛風(fēng)通絡(luò)、利濕泄?jié)岬淖饔?，主治喉痹、癰疽惡瘡、瘰癘、癌瘤、筋骨攣痛、水腫、淋濁、泄瀉、腳氣、濕疹疥癬、汞中毒。土茯苓含有多糖類、有機(jī)酸類、苯丙素類、黃酮及黃酮苷類、甾醇類、皂苷類及揮發(fā)油等多種化學(xué)成分。其中具有很強(qiáng)的抗氧化和消除自由基作用的類黃酮受到空前的重視[1~5]。

纖維素酶解輔助提取黃酮是較新的方法。湘西地區(qū)盛產(chǎn)土茯苓，本文擬采用植物纖維素酶解輔助乙醇法，對(duì)土茯苓中總黃酮的提取條件進(jìn)行研究，為湘西地區(qū)土茯苓的開發(fā)利用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

TC-15套式恒溫箱（海寧市新華醫(yī)療器械廠）；DHG-924A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器公司）；AY220型托盤電子分析天平（島津）；電子天平（中國(guó)凱豐集團(tuán)）；HH S21-4--S電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；PHS-4A實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)；SHB-3循環(huán)真空泵（上海申生科技有限公司）；SENCOR系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

土茯苓（湖南省吉首市某藥廠提供），YZ7-601植物提取復(fù)合酶（湖南尤特爾生化有限公司），95%乙醇（湖南匯虹試劑有限公司），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（不小于98.0%，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；硝酸鈉、氫氧化鈉（湖南匯虹試劑有限公司）、硝酸鋁（天津市大茂化學(xué)試劑廠）（均為分析純，不需處理直接使用）；去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品21.5 mg，用30%的乙醇溶解完全后，移入100mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、16.0、32.0mL于50mL容量瓶中，按徐雅琴等人的方法顯色測(cè)定[6,7]，用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定510nm處吸光度。

以蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸，得回歸曲線方程y=9.2283x+0.0139，R2=0.9987。

1.2.2 土茯苓總黃酮的提取方法

將采集的土茯苓自然曬干，用切片機(jī)切片，切片自然曬干，得土茯苓干片，備用。

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的土茯苓干片，置于三角燒瓶中，加入一定體積的乙醇和一定質(zhì)量的植物植物復(fù)合酶，調(diào)節(jié)水溶液pH值為一定值，在48℃水浴鍋中恒溫加熱，酶解一定時(shí)間，加入70%乙醇200mL，水浴鍋升溫至88℃，恒溫滅酶10min。冷卻，改為回流裝置，水浴加熱回流2h，提取液冷卻、過(guò)濾，濾液定容。取一定體積定溶液，用鋁離子顯色、紫外-可見分光光度法測(cè)定總黃酮濃度，計(jì)算總黃酮提取率。

1.2.3 土茯苓總黃酮測(cè)定方法

總黃酮提取液于250mL容量瓶中加入70%乙醇定容，搖勻。取2.0mL定容液于25mL容量瓶中，按徐雅琴等人的方法配置顯色溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其510.0nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算提取液總黃酮濃度，并按以下公式計(jì)算總黃酮提取率。

總黃酮提取率（%）=樣品中總黃酮質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100%

提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至粘稠狀，粘稠物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，放入真空恒溫干燥箱中一定溫度和壓力下恒溫干燥至恒重，粉碎得棕黃色粉末，即為土茯苓粗提物干粉，稱量。分別按下述公式計(jì)算干粉得率和干粉中總黃酮含量。

干粉得率(%) =干粉質(zhì)量/樣品質(zhì)量 × 100%

干粉總黃酮含量(%) =干粉中總黃酮質(zhì)量 / 干粉質(zhì)量 × 100%

1.2.4 最佳提取條件實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)影響總黃酮提取率的主要因素酶添加量、酶解時(shí)間、pH值等3個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，探討最佳提取條件，最佳提取條件通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證[8~10]。

1.2.4.1 酶添加量對(duì)總黃酮提取率影響

準(zhǔn)確稱取土茯苓干片6份，各30.0g，分別加入具塞錐形瓶中，各加入90mL 70%乙醇水溶液。再加入不同質(zhì)量的植物復(fù)合酶，使酶濃度為0%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、3.0%，控制溫度48℃，調(diào)節(jié)酶解介質(zhì)pH為4.8，酶解3.0h后，置于水浴鍋內(nèi)升至88℃，保持恒溫滅酶10min。加入200mL、70%的乙醇，回流2h，減壓抽濾，置于250mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。取一定體積定溶液，用鋁離子顯色、紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定總黃酮濃度，計(jì)算總黃酮提取率。考察酶添加量對(duì)土茯苓總黃酮提取率的影響。

1.2.4.2 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響

準(zhǔn)確稱取土茯苓干片6份，各30.0g，分別加入具塞錐形瓶中，各加入90mL 70%乙醇水溶液。再按土茯苓干片質(zhì)量各加入1.0%的植物復(fù)合酶，調(diào)節(jié)酶解介質(zhì)pH為4.8，置于48℃水浴鍋中，分別酶解0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h，酶解液升至88℃，保持恒溫滅酶10min。加入200mL、70%乙醇，回流2h，減壓抽濾，置于250mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，取一定體積定溶液，用鋁離子顯色、紫外-可見分光光度法測(cè)定總黃酮濃度，計(jì)算總黃酮提取率?？疾烀附鈺r(shí)間對(duì)土茯苓總黃酮提取率的影響。

1.2.4.3 pH值對(duì)總黃酮提取率影響

準(zhǔn)確稱取土茯苓干片6份，各30.0g，分別加入具塞錐形瓶中，各加入90mL 70%乙醇水溶液。再按土茯苓干片質(zhì)量各加入1.0%的植物復(fù)合酶，酶解時(shí)間為3h，置于48℃水浴鍋中，分別調(diào)節(jié)酶解介質(zhì)pH為4.0、4.5、4.5、5.0、6.0，水浴鍋內(nèi)升至88℃，保持恒溫滅酶10min。加入200mL、70%的乙醇，回流2h，減壓抽濾，置于250mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，取一定體積定溶液，用鋁離子顯色、紫外-可見分光光度法測(cè)定總黃酮濃度，計(jì)算總黃酮提取率?？疾靝H值對(duì)土茯苓總黃酮提取率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物復(fù)合酶酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶濃度對(duì)總黃酮提取率影響

酶添加量對(duì)土茯苓總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，酶的含量超過(guò)一定范圍時(shí)，黃酮類物質(zhì)的提取率反而下降，在1.0%時(shí)總黃酮得率達(dá)到最大值，繼續(xù)增大酶濃度，總黃酮得率反而逐漸下降，原因有待進(jìn)一步研究。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)土茯苓黃酮提取率影響

酶解時(shí)間對(duì)土茯苓總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，酶解時(shí)間增加，總黃酮提取率逐步增加達(dá)到一定值后逐漸趨于不變，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到2.0h時(shí)黃酮的提取率趨于不變。

2.1.3 pH值對(duì)土茯苓黃酮提取結(jié)果影響

PH值對(duì)土茯苓總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出：在介質(zhì)pH為4.5到5.0，總黃酮得率增加，在pH=5.0時(shí)達(dá)到最高，當(dāng)pH為5.5時(shí)總黃酮提取率降低。其原因可能是酶活性受介質(zhì)pH的影響，pH值不僅影響酶的構(gòu)象，而且也影響底物的解離狀態(tài)。

2.2 最佳提取條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)

由單因素實(shí)驗(yàn)得出酶解輔助法提取土茯苓總黃酮的最佳提取條件為：酶添加量1.0%，酶解時(shí)間3.0h，pH值5.0。

最佳提取條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單因素實(shí)驗(yàn)中各影響因素的最佳條件組合重現(xiàn)性良好。最佳條件下，粗提物干粉得率13.9%，干粉中總黃酮含量4.0%，總黃酮提取率為0.53 %。

3 結(jié)論

酶解輔助乙醇法提取土茯苓總黃酮的最佳條件為：酶濃度1.0%，酶解時(shí)間3.0h，酶解介質(zhì)pH為5.0；最佳條件下，粗提物干粉得率13.9%，干粉中總黃酮含量4.0%，總黃酮提取率為0.53 %。

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