暗紫貝母愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)研究

張波 ，李軍立，李玉鋒 *，何洋， 劉震東， 謝紫瑩

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都610075；3.成都國(guó)嘉制藥，四川 成都610036）

暗紫貝母（F.unibracteata Hisao et K.C.Hsia）為百合科藥用植物，其干燥鱗莖，有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳的功效，主治肺熱燥咳、咯痰帶血、痰多胸悶等癥[1]。由于暗紫貝母生長(zhǎng)環(huán)境特殊，喜寒涼氣候，野生分布于海拔3200～4500m的高山高原草地上，低于海拔3000m就不能生長(zhǎng)，很難人工引種栽培，加之其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量很少.，因此價(jià)格昂貴，且過(guò)度依賴于野生資源[2-4]。暗紫貝母鱗莖離體培養(yǎng)，有利于野生暗紫貝母的資源保護(hù)和開(kāi)辟藥材資源新途徑，實(shí)現(xiàn)中藥的現(xiàn)代化進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

暗紫貝母（F.unibracteata Hisao et K.C.Hsia）由四川省國(guó)嘉制藥新荷花藥材種植基地提供并鑒定。其他常見(jiàn)試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌材料的獲得 取暗紫貝母鮮鱗莖，先用自來(lái)水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干，然后用70%的乙醇浸泡1min，滅菌濾紙吸干，最后用0.1%的HgCl2浸泡消毒10min，無(wú)菌水沖洗5次，滅菌濾紙吸干。鱗莖切成約0.5cm的塊[1,2,5]。

1.2.2 外植體接入不同濃度配比的培養(yǎng)基 在無(wú)菌操作條件下，將上述塊狀鱗莖接種到pH5.8，蔗糖3%，VC0.1 g/L，附加 NAA+6-BA不同配比濃度的MS培養(yǎng)基上[1,6]。

1.2.3 培養(yǎng)方法 在0℃無(wú)菌條件下，培養(yǎng)48h后[4,6-8]，再在溫度：20℃，光照強(qiáng)度：1000-1500Lx，每天光照時(shí)間：16h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)[1,2]。

1.2.4 計(jì)算方法 培養(yǎng)50天后取材，統(tǒng)計(jì)接種外植體的數(shù)量，誘導(dǎo)出的愈傷組織數(shù)量、不定芽的數(shù)量，并計(jì)算其愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率[9-10]，最終確定誘導(dǎo)暗紫貝母愈傷組織和不定芽的NAA和6-BA的最佳配比濃度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鱗莖外植體接種到培養(yǎng)基上20d之后開(kāi)始逐漸生長(zhǎng)，一部分鱗莖體積逐漸增大，其切口處外部有透明淡黃綠色的小顆粒狀突起出現(xiàn)和（或）小的新芽生成，并且其誘導(dǎo)出的愈傷組織和不定芽體積逐漸增大，30d左右能夠清晰地看到半透明狀的質(zhì)地疏松的愈傷組織和白色的不定芽，50d后愈傷組織和不定芽生長(zhǎng)逐漸穩(wěn)定（見(jiàn)圖1）。培養(yǎng)50d后，將采集到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)制成表1和表2。

表1 不同配比濃度NAA+6-BA誘導(dǎo)的鱗莖外植體愈傷組織數(shù)量

表2 不同配比濃度NAA+6-BA誘導(dǎo)的鱗莖外植體不定芽數(shù)量

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3 鱗莖外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率（%）

從表3可知，不同濃度的激素組合會(huì)對(duì)鱗莖外植體愈傷組織的形成有一定影響，且其影響差異較為顯著。在NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L配比濃度的培養(yǎng)基上鱗莖外植體愈傷組織誘導(dǎo)率為53.3%，明顯高于其它濃度配比下的誘導(dǎo)率，比第二高誘導(dǎo)率高60%。

表4 鱗莖外植體不定芽的誘導(dǎo)率（%）

從表4可知，不同濃度的激素組合會(huì)對(duì)鱗莖新生芽的形成有一定的影響，且其影響差異較為明顯。在NAA1.2 mg/L +6-BA1.6 mg/L配比濃度的培養(yǎng)基上的鱗莖新芽生成率為73.3%，明顯高于其它濃度配比下的生成率，比第二高生成率高22.2%。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道貝母鱗莖再生途徑主要有三條：1、外植體先經(jīng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，再由愈傷組織分化發(fā)育形成不定芽，最后由不定芽形成新的小鱗莖；2、愈傷組織表層和內(nèi)層一些特化了的胚性細(xì)胞經(jīng)多次分裂發(fā)育形成胚狀體，進(jìn)而再由胚狀體形成小鱗莖；3、外植體表面直接生長(zhǎng)出小芽或鱗莖，適用于暗紫貝母培育，且培育時(shí)間相對(duì)較短[3]。本實(shí)驗(yàn)即采用第三條培養(yǎng)途徑，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較短，且直接培養(yǎng)可避免再次培養(yǎng)引起的霉變。由于本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件中光照時(shí)間為16h/d，所以誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)目多于愈傷組織，且不定芽的色澤為白色，而愈傷組織呈蛋黃綠色，為質(zhì)地疏松的半固態(tài)狀。

本實(shí)驗(yàn)借鑒低溫誘導(dǎo)對(duì)組培川貝母胚狀體成苗的影響[8]和紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)[6]中防褐變措施，采用外植體接種后先經(jīng)低溫處理48h再進(jìn)行培養(yǎng)的方法，此法可有效地抑制外植體內(nèi)在多酚氧化酶（PPO）引起的褐變[11]。一般PPO最適溫度為20-35℃，低溫前處理可有效地抑制外植體在培育初期極易產(chǎn)生的褐變，同時(shí)低溫也在一定程度上抑制了霉變的發(fā)生。添加了0.1g/L的cV也能在一定程度上抑制了褐變的發(fā)生[6]，但對(duì)于暗紫貝母的適用量仍需要在今后的實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證和討論。PPO的最適pH值在6.0—7.4范圍，大多在7.0-7.4范圍[11]，而組織培養(yǎng)要求培養(yǎng)基的pH為5.8，因此應(yīng)嚴(yán)格調(diào)試培養(yǎng)基的pH，也能從根本上抑制PPO的活性。

實(shí)驗(yàn)表明不同濃度NAA+6-BA配比對(duì)暗紫貝母鱗莖外植體新芽的生成和愈傷組織的形成有一定的影響。在本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下，NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L濃度配比誘導(dǎo)形成的愈傷組織較多；NAA1.2mg/L +6-BA1.6mg/L濃度配比誘導(dǎo)生成的新芽較多；NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L濃度配比條件下生成的新芽和愈傷組織均較多。綜合分析，NAA1.2mg/L為鱗莖誘導(dǎo)的適宜濃度，而愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)對(duì)6-BA濃度反應(yīng)則不同，但都為適中濃度，過(guò)高或過(guò)低的濃度的NAA +6-BA組合都不適宜鱗莖的誘導(dǎo)。

通過(guò)對(duì)暗紫貝母愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的研究，可以進(jìn)一步優(yōu)化和建立川貝母培養(yǎng)體系，解決野生貝母資源緊缺的問(wèn)題，為天然藥物的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

[1] 徐德然,高山林,蔡朝暉,等.暗紫貝母鱗莖培養(yǎng)中培養(yǎng)基的選擇和簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1992,23(5):304-306.

[2] 李隆云,周裕書(shū),付善全,等.康定貝母鱗莖離體繁殖研究[J].中藥材,1994,17(12):5-7.

[3] 耿茂林,馬琳,常莉,等.貝母組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].淮北煤炭師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,28(1):38-42.

[4] 尚宏芹.植物組織培養(yǎng)中的三大難題概述[J].生物學(xué)教學(xué),2010,35(6):64-66.

[5] 李玉峰,顏鈁,唐琳,等.濃蜜貝母的組織培養(yǎng)條件及不同時(shí)期生物堿積累的研究[J].中草藥,2003,33(5):458-459.

[6] 盛長(zhǎng)忠,王淑芳,王寧寧,等.紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的初探[J].南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001,34(4):120-121.

[7] K.Y.Paek,H.N.Murthy.High frequency of bulblet regeneration from bulb scale sections of Fritillaria thunbergii[J].PlantCell,Tissue and OrganCulture ,2002,68:247-252.

[8] 李強(qiáng),凌麗俐,傅華龍,等.低溫誘導(dǎo)對(duì)組培川貝母胚狀體成苗的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,40(3):367-370.

[9] 譚豐蘋(píng),高山林.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)組培暗紫貝母小鱗莖生長(zhǎng)的影響[J].植物資源與環(huán)境,1999,8(1):52-55.

[10] 高山林,朱丹妮,蔡朝暉.暗紫貝母鱗莖器官培養(yǎng)生長(zhǎng)特征和生物堿累積的研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1992,23(3):144.

[11] 張莉,陳乃富.多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,12(12): 29-30.