基質(zhì)金屬蛋白酶 MM P-9與其抑制劑 TIMP-1在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

盧北燕,王艷平

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,黑龍江 佳木斯 154003)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見的三大惡性腫瘤之一,約占女性總癌瘤的 7%,占女性生殖道惡性腫瘤的 20%～30%[1],近年來發(fā)病率有升高并且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢(shì),更是西方國家女性最常見的女性生殖道惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅人類健康[2]。本試驗(yàn)是通過子宮內(nèi)膜癌組織的免疫組化的研究 ,了解子宮內(nèi)膜癌患者組織中 MM P-9、TIM P-1的表達(dá),并采用多參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析該檢測(cè)結(jié)果,探討 MM P-9、TIMP-1在腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲中的作用,為子宮內(nèi)膜癌的臨床監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷提供新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科 2006—01～2009— 12住院手術(shù)并經(jīng)病理確診的 60例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者所存檔的組織蠟塊,所有患者術(shù)前均未作過任何化療、放療或性激素類藥物等治療,其中所有標(biāo)本的臨床和病理資料完整,病理診斷均經(jīng)其中所有標(biāo)本的臨床和病理資料完整,病理診斷均經(jīng)病理科專家復(fù)核?；颊吣挲g 31～ 73歲,平均 52歲,≤50歲者 32例,＞ 50歲者 28例;35例已絕經(jīng),25例未絕經(jīng);子宮內(nèi)膜樣腺癌按照 2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)手術(shù) -病理分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ 期 33例,Ⅱ期 23例,Ⅲ期 4例;組織學(xué)分級(jí):高分化(Gl)17例,中分化(G2)20例,低分化(G3)23例;子宮肌壁侵潤深度:無肌層浸潤 6例 ,侵及子宮壁淺肌層 (≤1/2肌層 )者 31例 ,侵及深肌層 (＞ 1/2肌層)者 23例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(行淋巴結(jié)清掃和取樣者):已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者6例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 28例。另取同期正常子宮內(nèi)膜組織(取自子宮肌瘤行手術(shù)切除術(shù)的患者)18例、非典型增生性子宮內(nèi)膜組織存檔蠟塊 23例作為對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng) 10%福爾馬林液固定,石蠟包埋,5μm厚連續(xù)組織切片。

1.2 方法及步驟

①脫蠟和水化:將組織切片經(jīng) 58℃烤片 1h,按以下次序脫蠟:二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各浸 10min;無水乙醇 10min;90%乙醇 10min;80%乙醇 10min;雙蒸水沖洗 3次;PBS浸洗 3min共 3次。②3%過氧化氫處理:浸于新鮮培植的 3%過氧化氫溶液中避光放置 10min,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。雙蒸水沖洗 3次,PBS浸洗 3min,共 3次。③抗原修復(fù):孵育盒中放人切片,并加入 50mL 0.01mol/L枸櫞酸緩沖液 (pH=6.0),于微波爐加熱中火 MV(95℃)5min共兩次,兩次之間加入10mL枸櫞酸緩沖液,第二次加熱以后從微波爐中取出孵育盒,自然冷卻至室溫(18～ 25℃),PBS浸洗 3min共 3次。 ④封閉:滴加 10%正常山羊血清封閉 30min,消除非特異性反應(yīng),甩去多余液體,不洗。⑤滴加一抗:分別滴加一滴 Bcl-xl鼠抗人單克隆抗體和兔抗人 Beclin1多克隆抗體,濕盒中孵育,4℃過夜 ,PBS浸洗 3min共 3次,小心擦拭多余液體。⑥滴加二抗:分別滴加一滴生物生化山羊抗兔 IgG,濕盒中孵育,37℃溫箱放置 50min,PBS浸洗 3min共 3次,小心擦拭多余液體。⑦滴加三抗:分別滴加一滴高敏過氧化物酶復(fù)合物,濕盒中孵育,37℃溫箱放置 50min,PBS浸洗 3min共三次,小心擦拭多余液體。⑧DAB-H2O2顯色:每張切片上滴加 1～ 2(30～ 40μL)滴顯色液于標(biāo)本上,置濕盒內(nèi)室溫顯色,一般顯色 5～ 15min。若無背景出現(xiàn)可繼續(xù)顯色 ,充分水洗。⑨復(fù)染:Harris蘇木素復(fù)染,充分水洗。L脫水、透明、封片:50%、75%、85%、95%和 100%系列乙醇脫水;二甲苯透明;重型光學(xué)樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。對(duì)照實(shí)驗(yàn):以 PBS替代一抗作為陰性對(duì)照,以試劑盒內(nèi)已知陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

光學(xué)顯微鏡下均以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色細(xì)胞,MM P-9與 TIM P-1的陽性顆粒均分布于細(xì)胞漿。判斷標(biāo)準(zhǔn):參考師建國[1,2]的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn):每例切片選取內(nèi)膜細(xì)胞密集的區(qū)域,連續(xù)觀察高倍視野,對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),每個(gè)視野計(jì)數(shù) 50個(gè)細(xì)胞,共 1000個(gè)細(xì)胞,通過計(jì)算著色細(xì)胞所占比例及評(píng)定著色強(qiáng)度而分級(jí)。①無著色細(xì)胞、背景同陰性對(duì)照或者陽性細(xì)胞比例不超過 5%者為陰性(-);②陽性細(xì)胞呈淡棕黃色和/或陽性細(xì)胞率 ＜50%者為弱陽性(+);③陽性細(xì)胞呈深棕黃色和 /或陽性細(xì)胞率≥50%者為強(qiáng)陽性(++)。陽性細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn):免疫組化的陽性表達(dá)均為各自染色條件下結(jié)構(gòu)完整、定位明確、染色對(duì)比清晰的棕黃色細(xì)胞。為便于統(tǒng)計(jì),將 (+)和(++)統(tǒng)歸為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用秩和檢驗(yàn),確切概率法及 Spearman等級(jí)相關(guān)分析,數(shù)據(jù)采用 SPSS 16.0軟件包分析。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MM P-9蛋白在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

MM P-9蛋白的表達(dá)主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿,呈棕黃色顆粒,彌漫性或局灶性分布。見表 1。

表 1 MM P-9在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

2.2 M MP-9蛋白與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征的關(guān)系

見表 2。

表 2 TIM P-1蛋白的表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

本研究采用免疫組化的方法,通過檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜腺癌組織中 MM P-9蛋白的表達(dá)得出初步結(jié)論:MMP-9蛋白在正常內(nèi)膜組織、不典型增生內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達(dá)率分別是16.67%、56.52%和 78.33%,三者之間的陽性表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在子宮內(nèi)膜由良性到惡性轉(zhuǎn)變的不同階段,M MP-9陽性表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì),說明其與子宮內(nèi)膜組織癌變關(guān)系密切,與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展演進(jìn)有關(guān),此結(jié)論與大多數(shù)研究的結(jié)論基本一致。結(jié)合患者的臨床病理特征進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn) 33例Ⅰ期子宮內(nèi)膜癌中,MM P-9蛋白陽性表達(dá)21例,23例Ⅱ期子宮內(nèi)膜癌中,MM P-9蛋白陽性表達(dá) 22例,4例Ⅲ A期患者 MMP-9的陽性表達(dá)為 4例,三者 M MP-9蛋白陽性表達(dá)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,晚期子宮內(nèi)膜癌中MM P-9蛋白的表達(dá)明顯高于早期。MM P-9通過降解細(xì)胞外基質(zhì),為腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤提供了有利條件,同時(shí)還為腫瘤新生血管的生長(zhǎng)提供了空間。Iurlaro等[3]用免疫組化、原雜交位技術(shù)檢測(cè)了 64例子宮內(nèi)膜癌及 15例正常對(duì)照組的 MM P-9的表達(dá)情況,子宮內(nèi)膜癌組織中 MM P-9的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組 (P＜0.01),并隨病理組織分級(jí)(Gl,G2,G3)和肌層浸潤程度的增加而表達(dá)增加,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相一致。近年來國內(nèi)外許多學(xué)者研究證明,MM Ps與 TIM Ps之間的相互作用在月經(jīng)發(fā)生、子宮內(nèi)膜的重塑、胚胎著床及胚胎種植等生理過程中起著關(guān)鍵的作用[4]。

本研究采用免疫組化的方法,通過檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜腺癌組織中 TIM P-1蛋白的表達(dá)得出初步結(jié)論:TIM P-1蛋白在正常內(nèi)膜組織、不典型增生內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達(dá)率分別是72.22%、65.22%和 41.67%,三者之間的陽性表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在子宮內(nèi)膜由良性到惡性轉(zhuǎn)變的不同階段,TIMP-1陽性表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì),說明其與子宮內(nèi)膜組織癌變關(guān)系密切,與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展演進(jìn)有關(guān),此結(jié)論與大多數(shù)研究的結(jié)論基本一致[3]。

本研究還結(jié)合患者的臨床病理特征進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn):(1)33例Ⅰ期子宮內(nèi)膜癌中,TIM P-1蛋白陽性表達(dá) 18例,23例Ⅱ期子宮內(nèi)膜癌中,TIM P-1蛋白陽性表達(dá) 5例,4例Ⅲ A期患者 TIM P-1的陽性表達(dá)為 0例,三者 TIMP-1蛋白陽性表達(dá)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,早期子宮內(nèi)膜癌中 TIMP-1蛋白的表達(dá)明顯高于晚期。 TIM P-1可與 MM P-9前體及有活性的 MM P-9形成高度親和的、非共價(jià)鍵結(jié)合的復(fù)合物。重要的是 TIM P-1與活化的或非活化的 92kDa的MM P-9的結(jié)合抑制了 MM P-9水解蛋白的活性 ,TIMP-1還被認(rèn)為作為一種轉(zhuǎn)錄抑制劑抑制 M MPs基因的轉(zhuǎn)錄[91];(2)G1組中的 TIM P-1蛋白陽性表達(dá)率高于 G3,TIM P-1蛋白的表達(dá)隨著病理分級(jí)的增加呈減少趨勢(shì),病理分級(jí)是反映腫瘤生物行為的最本質(zhì)特征之一,分化越差,其生物學(xué)行為越惡劣,預(yù)后越差;(3)無肌層浸潤的陽性表達(dá)明顯高于有肌層浸潤的患者;浸潤深度≤1/2組及浸潤深度＞1/2組的表達(dá)有顯著性差異并且隨肌層浸潤程度的加深其表達(dá)呈減少趨勢(shì);(4)TIMP-1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率差別不大,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與多數(shù)研究不一致,可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例太少有關(guān)。在 60例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者標(biāo)本中,MM P-9的陽性表達(dá)為 47例,而 TIMP-1的陽性表達(dá)為 23例。兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.603,P= 0.0004)。腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞合成的MM P-9,正好可以降解基底膜主要成分Ⅳ型膠原,從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。 TIM P-1是 MM P-9特異性抑制劑,TIM P-1可與 MM P-9前體及有活性的 MM P-9形成高度親和的、非共價(jià)鍵結(jié)合的復(fù)合物?？烧J(rèn)為兩者在腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中相互抑制、共同作用。由于手術(shù)-病理分期、組織分級(jí)、肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可反映疾病惡性程度 ,與患者預(yù)后相關(guān),對(duì) MM P-9、TIM P-1的測(cè)定可幫助臨床醫(yī)師判斷預(yù)后,指導(dǎo)臨床治療,因此于 MM P-9陽性而 TIM P-1陰性表達(dá)的患者制訂合理的綜合治療方案。

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