生化湯合劑微生物限度檢查方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)研究

(廣州市黃埔區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510700)

生化湯合劑是廣州市黃埔區(qū)中醫(yī)院院內(nèi)制劑，該制劑由益母草、當(dāng)歸、川芎、桃仁、牛膝等幾味中藥組成，具有活血逐瘀、養(yǎng)血止血功效，臨床主要用于產(chǎn)婦產(chǎn)后血瘀腹痛、惡露不盡等癥，療效顯著。本文按照《中國(guó)藥典》[1]2010年版要求,對(duì)生化湯合劑的微生物限度檢查方法進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，并用此方法對(duì)3批該制劑進(jìn)行檢驗(yàn)。

1 材料與儀器

1.1 菌種 大腸埃希菌[CMCC(B)44102]，金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]，白色念珠菌[CMCC (B) 98001]，黑曲霉菌[CMCC(B)98003]，均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.2 培養(yǎng)基 pH 7.0-氯化鈉蛋白胨緩沖液(批號(hào)：090703)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):100826)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：100520)，膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號(hào)：100916)，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：100625)，改良馬丁培養(yǎng)基(批號(hào)：090202)，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：100622)，4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養(yǎng)基(批號(hào):090326)，均為北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.3 供試品 生化湯合劑(規(guī)格：300 mL/瓶，廣州市黃埔區(qū)中醫(yī)院，批號(hào)：100514、100716、100721)。

1.4 儀器 電子天平(型號(hào)：JJ1000常熟市雙杰測(cè)試儀器廠)；自動(dòng)蒸汽滅菌器(型號(hào)：CL-32L ALP Co.Ltd Tokyo Japan)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：HH.B11.500上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；生化培養(yǎng)箱(型號(hào)：LRH-150B廣東省醫(yī)療器械廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,置于30～35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,置于23～28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。上述各培養(yǎng)物分別用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100 cfu/mL的菌懸液。接種黑曲霉新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置于23～28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，加入5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫,吸取孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每含孢子數(shù)為50～100 cfu/mL的孢子懸液。

2.2 供試液的制備 取供試品10 mL，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL混勻，作為1∶10的供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)測(cè)定方法的驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組 分別取供試液和上述制備好菌懸液各1 mL，注入無菌平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，其中加入大腸埃希菌菌液組、金黃色葡萄球菌菌液組和枯草芽孢桿菌菌液組分別傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后倒置于培養(yǎng)箱,30～35 ℃培養(yǎng)3 d,計(jì)數(shù)；加入白色念珠菌菌液組和加入黑曲霉菌液組分別傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后倒置于培養(yǎng)箱,23～28 ℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。

2.3.2 菌液組 分別取上述各菌液1 mL，注入平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng),照試驗(yàn)組方法培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。

2.3.3 供試品 對(duì)照組：取1∶10供試液1 mL，注入平皿中,照試驗(yàn)組方法培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。

2.3.4 試驗(yàn)結(jié)果 方法驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn),并分別計(jì)算各組試驗(yàn)回收率。結(jié)果見表1。各次試驗(yàn)試驗(yàn)組的回收率均高于70%，符合規(guī)定。

表1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果

回收率=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%。

2.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.4.1 試驗(yàn)組 取1∶10供試液10 mL和制備好的大腸埃希菌菌懸液1 mL，接種至100 mL已滅菌的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，于35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.4.2 供試品組 取1∶10供試液10 mL，接種至100 mL 已滅菌的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，于35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.4.3 陰性菌對(duì)照組 取1∶10供試液10 mL和制備好的金黃色葡萄球菌菌懸液1 mL，接種至100 mL已滅菌的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，于35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.4.4 陰性對(duì)照組 取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL，接種至100 mL已滅菌的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，于35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.4.5 取上述各組培養(yǎng)物0.2 mL，分別接種至各含5 mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，置于35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)物分別于5、24 h置365 nm紫外燈下觀察，觀察結(jié)果后，沿各培養(yǎng)管管壁分別加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察結(jié)果。

2.4.6 結(jié)果判斷 方法驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行3 次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌，供試品組、陰性菌對(duì)照組、陰性對(duì)照組均未檢出大腸埃希菌，陰性菌對(duì)照組未檢出陰性菌。

3 討論

細(xì)菌、霉菌及酵母菌方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，生化湯合劑中的各中藥成分無抑菌作用，可采用平皿法對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌微生物限度檢測(cè)方法檢測(cè)?？刂凭椒?yàn)證結(jié)果表明，采用常規(guī)法檢查大腸埃希菌方法有專屬性，不受其他菌的干擾。

《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時(shí)，需進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查方法的驗(yàn)證,以確認(rèn)所采用方法適合于該藥品的檢查[2]。當(dāng)藥物的生產(chǎn)方法變更、制劑組分發(fā)生改變、檢查法修訂或檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí),檢查方法也應(yīng)重新進(jìn)行驗(yàn)證，尤其是中成藥制劑,而不同藥品的微生物驗(yàn)證方法不盡相同,故方法的設(shè)計(jì)至關(guān)重要[3]。本文介紹的微生物驗(yàn)證方法為中藥制劑的微生物檢查的驗(yàn)證提供了參考。

[1]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:附錄107-116.

[2]鄭繼明,朱婕妤.理氣解郁合劑微生物限度檢查方法驗(yàn)證[J].海峽藥學(xué),2010,22(10):75-77.

[3]湯大妹,汪健,趙勤,等.參味合劑微生物限度檢查方法的驗(yàn)證[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2010,14(1):69-70.