組織塊法與傳統(tǒng)破骨細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)骨吸收功能的比較研究

王正東，顏南，曾亮，劉自力，臧晉，姜海波

(1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110034;2.醫(yī)學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院康復(fù)教研室)

破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)對(duì)從細(xì)胞與分子水平上來(lái)研究骨吸收機(jī)理與篩選骨質(zhì)疏松癥防治藥物等有很重要的意義。單獨(dú)純化培養(yǎng)的破骨細(xì)胞沒(méi)有骨吸收功能，只有與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，破骨細(xì)胞才具有骨吸收功能。本文應(yīng)用組織塊法與傳統(tǒng)破骨細(xì)胞培養(yǎng)方法來(lái)研究對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:1 d齡Wistar大鼠6只 (雄雌均可)由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。材料:高糖Dulbecco＇s Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品，1%甲苯胺藍(lán)染液、萘酚AS-BI磷酸酯 (Sigma公司)，副品紅 (上海新中化學(xué)廠)。

1.2 薄骨片及玻片制備與處理 薄骨磨片的制備及處理:取新鮮成年牛股骨皮質(zhì)－20℃貯存。臨用前鋸成1 cm寬條后，用磨片機(jī)磨成厚50μm的1 cm×1 cm骨片，蒸餾水清洗10次，置于體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇浸泡24 h，自然晾干，紫外線照射消毒骨片的兩面，放于DMEM中4℃?zhèn)溆?。玻片的制?將玻片切成1 cm×1 cm大小，泡酸過(guò)夜，自來(lái)水沖洗干凈，蒸餾水洗3遍，烤箱烤干，高壓消毒滅菌后備用。

1.3 細(xì)胞分組培養(yǎng) 取6只1 d齡Wistar大鼠斷頸處死，無(wú)菌取其四肢長(zhǎng)骨，在磷酸鹽緩沖液中盡可能去除附著在其表面的軟組織。將骨干置于DMEM培養(yǎng)基 (含體積分?jǐn)?shù)為0.15的胎牛血清［1］，4μmol/L谷氨酰胺)中，縱行剖開(kāi)，刮骨髓腔及靠近干骺端處內(nèi)表面直至骨干成為極微小的碎片，組織塊組直接接種于24孔板，而傳統(tǒng)組則接下來(lái)將刮取的極微小碎片進(jìn)行2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min，300目篩網(wǎng)過(guò)濾，吸管反復(fù)吹洗篩網(wǎng)上殘?jiān)?，吸取濾過(guò)懸液，4℃ 1 000 r/min離心10 min，棄上清，加4 ml DMEM培養(yǎng)基吹打均勻，接種于24孔板，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液，每孔2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)［2］。培養(yǎng)液每24 h時(shí)換1次。

1.4 活體觀察 應(yīng)用相差倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)與運(yùn)動(dòng)情況，并攝影記錄。培養(yǎng)成功后進(jìn)行標(biāo)志酶染色。

1.5 破骨細(xì)胞特異性酶活性檢測(cè) 抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色 :孵育液A液:0.1 mol/L醋酸緩沖液，B液:六偶氮副品紅，C液:取萘酚AS-BI磷酸酯加入N，N-二甲基甲酰胺溶解。將3種孵育液等比例混勻，調(diào)pH5.0，加入酒石酸鉀鈉配成TRAP孵育液，以不含萘酚AS-BI磷酸鈉的孵育液作為陰性對(duì)照。玻片上培養(yǎng)3d的破骨細(xì)胞經(jīng)25 g/L戊二醛4℃固定后放入孵育液內(nèi)，37℃孵育50 min，10 g/L甲苯胺藍(lán)復(fù)染，甘油明膠封固。

1.6 骨片吸收陷窩定量分析 (1)骨片吸收陷窩計(jì)數(shù):參照文獻(xiàn)［3］，在培養(yǎng)第3天取出各組骨片，2.5%戊二醛固定液固定7 min，0.25 mol/L氫氧化銨中超聲清洗5 min×3次，系列酒精脫水，自然晾干。1%甲苯胺藍(lán)染液室溫染色3～4 min，蒸餾水清洗后光鏡下觀察，100倍下對(duì)整張骨片作陷窩計(jì)數(shù)，結(jié)果以陷窩數(shù)/骨片表示。(2)吸收陷窩面積分析:以上各組經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色骨片于400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍攝照片，采用計(jì)算機(jī)MetaMorph/Dp10/BX41分析系統(tǒng)勾畫(huà)出骨陷窩輪廓，計(jì)算并比較各組陷窩面積。(3)吸收陷窩深度分析:以上各組經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色骨片于400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍攝照片，由于陷窩著色深淺與其深度有關(guān)，采用計(jì)算機(jī)MetaMorph/Dp10/BX41分析系統(tǒng)計(jì)算各組骨片上陷窩染色的平均光密度值，并以此比較各組陷窩深度的差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以 (均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 相差倒置顯微鏡觀察 在培養(yǎng)3 d組織塊組的成骨細(xì)胞數(shù)量明顯多于傳統(tǒng)組 (圖1、2)，破骨細(xì)胞含幾個(gè)到十幾個(gè)細(xì)胞核。細(xì)胞形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而不斷變化。

圖4 光鏡下觀察去除細(xì)胞的骨片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色

2.2 TRAP染色光鏡觀察 破骨細(xì)胞形態(tài)各異，酶活性部位呈紅色顆粒樣沉淀，分布于全部或大部分胞漿，細(xì)胞核呈陰性，同片的其他細(xì)胞不著色 (圖3)，傳統(tǒng)組不顯色。

2.3 骨片吸收陷窩的形態(tài)特征 取培養(yǎng)3 d的骨片甲苯胺藍(lán)染色后在光鏡下觀察，可見(jiàn)吸收陷窩呈藍(lán)紫色圓形、橢圓形、臘腸形等多種形態(tài)，邊界清楚，陷窩底纖維紋路隱約可辨 (圖4)。

2.4 骨片吸收陷窩定量分析 骨片吸收陷窩計(jì)數(shù)、面積、深度分析見(jiàn)表1。

表1 骨片吸收陷窩定量分析

3 討論

破骨細(xì)胞骨吸收功能有關(guān)的酶為酸性磷酸酶，組織化學(xué)染色證實(shí)破骨細(xì)胞胞漿內(nèi)含有豐富的酸性磷酸酶，可是成骨細(xì)胞也含有少量的酸性磷酸酶，只有TRAP是破骨細(xì)胞的酸性磷酸酶同功酶，為破骨細(xì)胞所特有，作為鑒別破骨細(xì)胞的重要標(biāo)志。本文TRAP染色結(jié)果顯示破骨細(xì)胞胞漿呈紅色，核呈陰性。

破骨細(xì)胞在骨片上形成吸收陷窩，其數(shù)量、大小和深度直接反映破骨細(xì)胞骨吸收的能力大小。觀察陷窩的數(shù)量和測(cè)量陷窩的大小、深度是檢測(cè)破骨細(xì)胞骨吸收功能的可靠指標(biāo)。高建軍等［3］研究表明:掃描電鏡可清晰準(zhǔn)確地觀察骨片吸收陷窩，但技術(shù)較復(fù)雜，花費(fèi)較大，難以推廣應(yīng)用。發(fā)現(xiàn)甲苯胺藍(lán)的觀察效果與破骨細(xì)胞的吸收程度有關(guān)并經(jīng)掃描電鏡觀察所證實(shí)。骨片上吸收陷窩計(jì)數(shù)同掃描電鏡計(jì)數(shù)結(jié)果也基本一致。因而可以應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色技術(shù)結(jié)合普通光鏡觀察替代傳統(tǒng)的掃描電鏡技術(shù)對(duì)骨片上吸收陷窩數(shù)目定量計(jì)數(shù)，方法簡(jiǎn)便、快速、可靠。

本實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)胞與細(xì)胞直接接觸的方式，以研究成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化、成熟及其活性的影響。1，25(OH)2D3作為破骨細(xì)胞成熟的主要激活因子，具有明顯促進(jìn)骨吸收的作用，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式為維生素D3受體轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［4］，但其特異性受體只存在于成骨細(xì)胞及前成骨細(xì)胞的細(xì)胞膜上，破骨細(xì)胞膜上并無(wú)其受體。因此，它對(duì)體外分離培養(yǎng)的破骨細(xì)胞并無(wú)作用，只有在成骨細(xì)胞存在時(shí)，才能刺激破骨細(xì)胞性骨吸收的形成。

激活核因子NFκB受體的配體 (receptor activator of nuclear kappa B ligand，RANKL)、骨保護(hù)素 (osteoprotegerin，OPG)和NFκB受體活化因子(receptor activaror of NFκB，RANK)形成一個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，影響破骨細(xì)胞的生成。當(dāng)胞外刺激因素作用于成骨/基質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)其膜上表達(dá)RANKL分子，通過(guò)與破骨細(xì)胞膜上的RANK直接結(jié)合，而后破骨細(xì)胞內(nèi)的腫瘤壞死因子受體關(guān)聯(lián)因子 (TNFR assiated factors，TRAF)與RANK的胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，將信號(hào)傳入前體細(xì)胞，引起級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，使破骨細(xì)胞分化成熟［5］。而 OPG則由成骨/基質(zhì)細(xì)胞旁分泌發(fā)揮作用，競(jìng)爭(zhēng)性與RANKL結(jié)合，封閉RANKL與RANK的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟［6］。

本實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是組織塊法還是傳統(tǒng)法都是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的共培養(yǎng)，只不過(guò)組織塊法培養(yǎng)方法中成骨細(xì)胞的比例高，組織塊法共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的數(shù)量急劇減少，可能與成骨細(xì)胞比例高有關(guān)。那么組織塊法共培養(yǎng)體系中由于破骨細(xì)胞不能增殖和傳代而成骨細(xì)胞是不斷增殖的，所以共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞的數(shù)量在培養(yǎng)過(guò)程中增加較快，成骨細(xì)胞旁分泌OPG與RANKL的相對(duì)比例增加，競(jìng)爭(zhēng)性與RANKL結(jié)合，封閉RANKL與RANK的結(jié)合，使信號(hào)無(wú)法傳入，從而抑制了破骨細(xì)胞的分化和成熟，導(dǎo)致了破骨細(xì)胞骨吸收功能下降。然而，對(duì)于成骨細(xì)胞是如何抑制破骨細(xì)胞分化的生物學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

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［6］ Boyce BF，Xing L.Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling ［J］.Arch Biochem Biophys，2008，473(2):139－146.