骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療兔膝RA模型軟骨損傷的MRI評(píng)價(jià)

周鐘珩，崔延安，劉 釗，劉紅霞，黃海青，張全彬

（1.江蘇省中醫(yī)院MR室，江蘇 南京 210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院骨科中心，江蘇 南京 210006）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其基本病理特征是滑膜組織炎性增生伴關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞。前期研究中已證實(shí)MRI能夠評(píng)價(jià)RA的滑膜增厚和軟骨的破壞情況[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有多向分化潛能，在特定條件下可分化為軟骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)主要利用MRI觀察BMSCs治療兔膝RA模型后關(guān)節(jié)軟骨的前后變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性純種新西蘭大白兔42只（南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），月齡6.3～8.0個(gè)月，平均 （6.9± 0.4）個(gè)月；體重為2.8～3.2kg，平均（3.0±0.1）kg。觀察動(dòng)物的食量、大小便、活動(dòng)度、步態(tài)及精神狀況，無明顯異常后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制備與分組

1.2.1 RA模型制備

用卵蛋白（美國(guó)Sigma公司）造模，于右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入5mg溶解的卵蛋白，24h內(nèi)此關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛等急性炎癥表現(xiàn)。

1.2.2 BMSCs提取和制備

于右脛骨平臺(tái)下內(nèi)側(cè)松質(zhì)骨穿刺，抽取骨髓1.5～2.0ml，使用肝素液抗凝，參照文獻(xiàn)[2]方法分離和培養(yǎng)BMSCs。于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)傳代培養(yǎng)。取第2代（P2）細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測(cè)：CD34及CD68表達(dá)呈陰性，CD105表達(dá)呈陽性。鑒定后，P2細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，制成1×107/ml細(xì)胞懸液。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組和處理

選取新西蘭大白兔42只，造模第4周取6只兔治療前行MR和病理檢查以對(duì)照，余36只隨機(jī)分2組，即RA模型組和BMSCs治療組，每組18只，BMSCs治療組于造模后第4周在右后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BMSCs懸液0.3ml；RA模型組給予等量的無菌生理鹽水于右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射。兩組于治療后1、2、3個(gè)月分別選取6只兔行MR和病理檢查。

1.3 MR檢查方法及參數(shù)

采用Siemens Avanto 1.5T超導(dǎo)磁共振掃描儀行右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)MR檢查，各組經(jīng)耳緣靜脈注射25mg/kg戊巴比妥鈉全麻后，左側(cè)臥位，右膝在上，沙袋固定，應(yīng)用圓極化柔性小線圈矢狀面掃描；應(yīng)用三維脂肪抑制快速進(jìn)動(dòng)成像序列 （FS-3D-FISP）和三維脂肪抑制擾相梯度回波序列 （FS-3D-FLASH）平掃，并加用FS-3D-FLASH序列增強(qiáng)掃描。FS-3D-FISP的主要參數(shù)為TR 38ms，TE 10ms，翻轉(zhuǎn)角40°，層厚1.5mm，F(xiàn)OV 180mm，掃描矩陣512×384，平均激勵(lì)1次，掃描時(shí)間440s。FS-3D-FLASH的主要參數(shù)為TR 28ms，TE 4176ms，層厚1.5mm，F(xiàn)OV 180mm，掃描矩陣192×192，平均激勵(lì)1次，掃描時(shí)間489s。增強(qiáng)劑應(yīng)用Gd-DTPA按0.2mmol/kg，耳緣靜脈注入，20～30min后掃描。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般情況

觀察動(dòng)物的食量、大小便、活動(dòng)度、步態(tài)及精神狀況。

1.4.2 MRI觀察測(cè)量

觀察右后膝關(guān)節(jié)軟骨厚度改變，測(cè)量在Siemens Leonardo VD10B工作站上進(jìn)行。對(duì)右后膝軟骨厚度進(jìn)行連續(xù)測(cè)量，取平均值。

1.4.3 標(biāo)本處理及病理評(píng)分

MRI檢查完畢后采用麻醉法處死實(shí)驗(yàn)兔，在膝關(guān)節(jié)上下1.0～1.5cm處用銳利器械切斷，整塊取下股骨髁部、脛骨平臺(tái)及關(guān)節(jié)囊，觀察大體情況后固定于4%的福爾馬林溶液1天，再脫鈣2周，HE、Masson染色，光鏡下觀察組織形態(tài)變化。關(guān)節(jié)軟骨破壞采用Mankin法[4]對(duì)軟骨結(jié)構(gòu)的破壞深度、細(xì)胞分布、染色以及潮線的完整性進(jìn)行綜合評(píng)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

建模后動(dòng)物精神狀態(tài)和進(jìn)食良好，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均成活到預(yù)定觀察時(shí)間。

2.1 MRI觀察軟骨厚度的改變

關(guān)節(jié)軟骨在FS-3D-FISP和FS-3D-FLASH序列上表現(xiàn)為條狀弧形高信號(hào)，覆蓋在股骨髁和脛骨平臺(tái)的表面，信號(hào)均勻，邊緣光整。造模4周治療前顯示關(guān)節(jié)軟骨變薄，局部有凹陷，部分軟骨信號(hào)消失，滑膜積液，但軟骨下骨未受累，F(xiàn)S-3D-FISP和FS-3D-FLASH序列呈高信號(hào) （圖 1），F(xiàn)S-3DFLASH延時(shí)增強(qiáng)呈高信號(hào)。RA組經(jīng)1、2、3個(gè)月后，軟骨厚度變?。▓D2），但積液減少。BMSCs治療組：治療1、2、3個(gè)月后，關(guān)節(jié)軟骨厚度恢復(fù)，輪廓顯示（圖3，4），其中2例軟骨腫脹明顯，1例軟骨厚度恢復(fù)不明顯，關(guān)節(jié)腔積液消失。治療前后兩組兔膝關(guān)節(jié)軟骨MR測(cè)量數(shù)據(jù)見表1，各組不同的治療時(shí)間軟骨厚度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；組間比較BMSCs治療組軟骨破壞恢復(fù)情況明顯優(yōu)于RA組 （P< 0.01）；各組兩兩比較除RA組治療前與治療后1月軟骨厚度改變沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外（P>0.05），余均有明顯差異（P<0.01）。

表1 各組兔右膝MRI軟骨厚度（±s，mm）

表1 各組兔右膝MRI軟骨厚度（±s，mm）

注：治療前后各組軟骨厚度，1，2：P<0.01；與RA組比較，1，2：P< 0.01；兩兩比較除RA組治療前與治療后1月，P>0.05，余各組P<0.01。

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2.2 組織學(xué)觀察

正常兔膝關(guān)節(jié)HE染色示軟骨基質(zhì)基本呈均勻粉紅染色，軟骨表層無裂隙，無缺損，分4層有序排列。表層細(xì)胞呈梭形，近似水平排列；中間層細(xì)胞圓形，散在分布；深層細(xì)胞呈柱狀排列；潮線清晰；鈣化層細(xì)胞較大，呈散在分布。造模4周可以看到軟骨表面有蟲蝕樣改變（圖5）。RA組2月及3月時(shí)關(guān)節(jié)面粗糙、侵蝕，關(guān)節(jié)軟骨組織破壞,軟骨表面糜爛、血管翳形成，可見纖維軟骨細(xì)胞修復(fù)，細(xì)胞排列較亂，無明顯軟骨爬行。BMSCs治療組：治療后1月軟骨表面少量軟骨細(xì)胞樣新生細(xì)胞；治療2月時(shí)，可看到軟骨表面軟骨細(xì)胞增生，呈纖維細(xì)胞樣排列，伏在缺損軟骨表面，缺損區(qū)軟骨充填周邊至中心由厚變?。▓D6）；治療3月時(shí)，軟骨表面可見到軟骨細(xì)胞增生，與其他殘存軟骨相連，排列基本規(guī)則，其厚度趨于一致（圖7）。治療前后兩組兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分見表2。各組不同的治療時(shí)間軟骨評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），組間比較和各組兩兩比較均有明顯差異（P<0.01）。

表2 各組兔軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果（±s）

表2 各組兔軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果（±s）

注：治療前后各組軟骨Mankin評(píng)分，1，2：P<0.01；與RA組比較，1，2：P<0.01；兩兩比較，P<0.01。

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2.3 MRI測(cè)量與病理學(xué)評(píng)分的相關(guān)性

RA模型組和BMSCs治療組兔膝關(guān)節(jié)軟骨厚度MRI測(cè)量數(shù)據(jù)與病理學(xué)Mankin評(píng)分間相關(guān)系數(shù)r=-0.99和r=-0.998，P<0.05，說明兔膝關(guān)節(jié)軟骨厚度MRI測(cè)量數(shù)據(jù)與病理學(xué)Mankin評(píng)分有相關(guān)性（負(fù)相關(guān)）。

3 討論

RA具體的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，由于大量淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)于滑膜間質(zhì)，從而形成慢性滑膜炎、滑膜增生，隨后血管增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸形成血管翳，其覆蓋軟骨后導(dǎo)致其變性和降解。

3.1 MRI序列的選擇及其價(jià)值

本實(shí)驗(yàn)采用FS-3D-FLSAH和FS-3D-FISP序列對(duì)兔膝關(guān)節(jié)進(jìn)行掃描，觀察關(guān)節(jié)軟骨改變，前者為擾相梯度回波，結(jié)合T1加權(quán)成像；后者屬于聚相位梯度回波，結(jié)合T2加權(quán)成像。FS-3D-FISP序列對(duì)軟骨顯示研究相對(duì)較少，本序列有良好的信噪比，軟骨呈高信號(hào)，而關(guān)節(jié)積液信號(hào)更高，有類似關(guān)節(jié)造影的效應(yīng)，容易顯示出軟骨缺損輪廓。FS-3D-FISP序列結(jié)合水脂分離能獲得高分辨圖像，并減少圖像采集時(shí)間，與3D-FS-FLASH相比成像時(shí)間縮短了42%以上[4]。張敏等[5]和岳云龍等[6]研究認(rèn)為FS-3D-FISP序列檢查與關(guān)節(jié)鏡診斷結(jié)果之間具有良好的一致性。實(shí)驗(yàn)中病損的關(guān)節(jié)軟骨在平掃的 FS-3DFLASH和FS-3D-FISP序列中信號(hào)不均，或變薄、缺損，但在增強(qiáng)的FS-3D-FLASH掃描中關(guān)節(jié)軟骨仍呈條樣高信號(hào)，這是由于Gd-DTPA通過滲透方式進(jìn)入關(guān)節(jié)軟骨，軟骨變性早期，軟骨基質(zhì)內(nèi)蛋白多糖（主要成分為氨基葡聚糖）丟失，作為帶負(fù)電荷的Gd-DTPA就可以逐漸滲透至關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)，取代氨基葡聚糖位置而顯示軟骨的形態(tài)[7-10]。但是，研究表明，隨時(shí)間的變化，病變軟骨與正常軟骨強(qiáng)化程度不同[11]，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用平掃或增強(qiáng)早期序列測(cè)量軟骨較為可靠。兔膝較小，須采用3D掃描技術(shù)作連續(xù)薄層（層厚1~1.5mm）掃描，提高空間分辨率，減少部分容積效應(yīng)和信息的丟失，增加對(duì)微小病灶的檢出能力。脂肪抑制（FS）能夠應(yīng)用于各種MR掃描序列中，增加軟骨和骨髓及液體的對(duì)比度，減小化學(xué)位移偽影，能夠獲得關(guān)節(jié)軟骨與周圍鄰近組織結(jié)構(gòu)的良好對(duì)比。采用脂肪抑制3D-FLASH和3D-FISP序列對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的顯示和病變分級(jí)的準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于非脂肪抑制的3D梯度回波序列[12]。標(biāo)本測(cè)量關(guān)節(jié)軟骨厚度，與MRI所見厚度高度相關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)每只兔都通過MRI測(cè)量，其數(shù)據(jù)與病理學(xué)評(píng)分有明顯的相關(guān)性。

3.2 BMSCs具有組織損傷修復(fù)能力

BMSCs體外培養(yǎng)增殖迅速，經(jīng)適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)可向中胚層的骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可作為組織工程研究的細(xì)胞來源。國(guó)內(nèi)外多位作者[14-17]報(bào)道了利用BMSCs構(gòu)建骨、軟骨聯(lián)合移植物的可行性，用載體或直接將BMSCs植入軟骨缺損處，最后都證實(shí)BMSCs能向軟骨表型分化，促進(jìn)缺損軟骨成功修復(fù)。但以上研究所制作的都是軟骨缺損的動(dòng)物模型而非RA模型，雖然兩者都是軟骨破壞，但前者無法模擬RA所特有的病理和臨床表現(xiàn)。目前BMSCs在體內(nèi)具有分化產(chǎn)生軟骨細(xì)胞的能力已經(jīng)證實(shí)，Hegewald等[18]使用透明質(zhì)酸和自體滑膜液誘導(dǎo)馬BMSCs分化為軟骨細(xì)胞，說明關(guān)節(jié)天然環(huán)境有利于成軟骨分化，這為本實(shí)驗(yàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BMSCs形成透明軟骨細(xì)胞提供了理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中RA模型組關(guān)節(jié)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，軟骨厚度在減少，而病理評(píng)分在增加，這是由于慢性滑膜炎及新生血管翳對(duì)軟骨的侵蝕所致。而BMSCs治療組隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，除分別有1例軟骨厚度和病理評(píng)分改變沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，余12例軟骨厚度在明顯恢復(fù)，病理評(píng)分減低明顯，說明BMSCs在關(guān)節(jié)腔內(nèi)可誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有一定的修復(fù)作用。分析3例改變不明顯的原因，可能由于注射的BMSCs懸液流失未聚積在缺損部位所致，如果用可吸收載體效果可能會(huì)更好。

綜上所述，BMSCs兔膝RA關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射可分化為軟骨細(xì)胞，修復(fù)RA早期階段關(guān)節(jié)軟骨的退變和破壞。由于條件所限，本研究尚顯粗糙：首先樣本量較小，有待大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)；其次由于標(biāo)本較小，因主觀因素，數(shù)據(jù)測(cè)量和評(píng)分仍然存在一定的誤差；最后雖然所見的透明樣軟骨修復(fù)組織能成功的充填軟骨缺損，但與正常關(guān)節(jié)軟骨相比，其強(qiáng)度、通透性、膠原纖維的方向性和結(jié)構(gòu)以及蛋白聚糖與膠原網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系等都未能檢測(cè)。BMSCs在關(guān)節(jié)腔內(nèi)向軟骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

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