家兔精液品質(zhì)評定方法的研究進展

鄭 潔，謝曉紅，易 軍，雷 岷，任永軍，張翔宇

（四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066）

人工授精應用到家兔生產(chǎn)中已經(jīng)有20多年的歷史，該方法比傳統(tǒng)的自然交配更能集中分娩，在生產(chǎn)管理上更具有計劃性。由于家兔精子的質(zhì)量直接關系到精子的活力和受胎率，能否客觀地評價精子質(zhì)量和活力是人工授精和體外受精技術的關鍵，因此如何評定精子質(zhì)量成為了人們關心的話題。本文將對家兔精液質(zhì)量評定的方法和研究進展進行闡述。

1 家兔精液量、精子密度和形態(tài)

家兔精液量采用微量移液器直接測定。精子密度可采用血細胞計數(shù)板在光學顯微鏡下直接計數(shù)。精液形態(tài)可采用光學顯微鏡直接觀察記錄。這些方法帶有一定的人為誤差，但操作簡單易行，不需要昂貴的儀器，特別適合臨床和現(xiàn)場使用，屬于常規(guī)檢測方法。目前多運用流式細胞儀和計算機輔助精子分析儀（CASA）來分析精子的密度和運動形態(tài)。流式細胞儀通過測量精子及其他顆粒的散射光來快速分析顆粒的物理和化學性質(zhì)，并對細胞進行分類收集，可以高速分析大量的精子，但該方法耗資較高，限制了其在生產(chǎn)上的應用。CASA是在光學技術的基礎上結(jié)合計算機圖像識別、運動圖像處理技術發(fā)展起來的精子運動能力的綜合分析方法。這種方法不僅提高了檢測結(jié)果的客觀性和快速性，還引入直線運動速度（VSL），曲線運動速度（VCL）、平均路徑速度（VAP）、運動的前向性（STR）、直線性（LIN）、擺動性（WOB）和鞭打頻率（BCF）等傳統(tǒng)檢測方法不能提供的參數(shù)。準確的CASA分析結(jié)果能預測精子的受精能力和人工授精的受胎率。但是CASA分析樣品的準確性受到諸多因素的影響，如精子濃度、樣品中細胞的成分、非細胞顆粒的干擾、測量中精液的流速和精子計數(shù)池的型號等。自動、快速分析精子質(zhì)量是今后精子質(zhì)量檢測的重要發(fā)展方向，因此建立一種標準條件下的CASA分析方法是非常有必要的。

2 家兔精子運動力

運動力保證精子在受精過程中與卵子相遇，并完成對卵膜的機械穿透作用，通常是用精子活力來評價。精子活力是指有向前運動能力的精子數(shù)與總精子數(shù)的比例。通常正常運動的精子在普通光學顯微鏡下可直接觀察記錄，但是這種方法存在主觀誤差，因此精子活力并不是評定精子潛在受精能力的一個可靠指標。雖然精子活力并不能直接反映其受精能力，但是精子的正常運動是精子能夠到達受精部位的基礎。

現(xiàn)在，精子活力可采用CASA和精子質(zhì)量分析儀（SQA）來分析。SQA是通過把精子運動所引起的光密度值（OD值）的變化轉(zhuǎn)化為電信號，再把這類波樣電信號轉(zhuǎn)化為精子活動指數(shù)（SMI）來評定精子的運動狀態(tài)的。SQA可以檢測總精子密度、TFSC、正常形態(tài)精子百分率、SMI和精子活動率等指標。SMI值與精子的密度和運動精子的百分率等存在相關性，并且死精子不影響SMI值。據(jù)報道，SQA檢測的SMI與CASA分析的向前運動的精子密度之間存在顯著相關，說明用SQA分析精子運動性具有一定的可靠性。但是SQA不能同時分析精液中的紅細胞和白細胞，也存在精液未稀釋而影響檢查結(jié)果的問題。

3 家兔精子活率

精子活率是指活精子數(shù)與總精子數(shù)的比率，在普通光學顯微鏡下檢測，是檢測精子質(zhì)量的常規(guī)指標。家兔精子活率檢測中常把觀察到的運動精子作為活精子，以此來計算精子活率，10%呈直線運動的其活力為0.1，20%呈直線運動的其活力為0.2，以此類推，滿分為1。這種方法受溫度、液體黏稠度以及人為因素的影響，精子活率檢測結(jié)果的主觀性很強。目前檢測家兔精子活率的方法有：常規(guī)染色法和熒光染色法。

常規(guī)染色方法有伊紅、伊紅-苯胺黑和中性紅3種。伊紅帶有陰離子，能滲透到死精子內(nèi)部與陽離子結(jié)合而呈紅色，活精子因細胞膜完整而不能著色。中性紅為水溶性染料，能通過活精子的細胞膜儲存于細胞內(nèi)，使其著色，而死精子不著色。最后，通過統(tǒng)計染色精子數(shù)來評價精子活率。但是在常規(guī)染色過程中，精子容易受到損傷而死亡，使其活率低于實際值。

熒光染色技術按其染色作用機理分為兩類：一類是染色劑進入死亡精子的受損質(zhì)膜內(nèi)部使其著色。溴化乙錠（EB）、溴乙啶二聚體（EH）、碘化丙錠（PI）和Hoechst3258等都是死精子特異性的熒光探針。另一類是某些染色劑本身沒有熒光性，卻能進入活體精子細胞內(nèi)部，在各種非特異性酯酶的作用下轉(zhuǎn)化為呈現(xiàn)綠色熒光的熒光物質(zhì)，這些產(chǎn)物不能通過完整的細胞質(zhì)膜。羧基熒光素雙醋酸鹽（CFDA）、羧基二甲基熒光素雙醋酸鹽（CDMFDA）、鈣黃素乙?；谆ィ–AM）、Hoechst33342和SYBR-14等都是活精子特異性的熒光探針。目前，實際檢測中更傾向于兩類熒光探針的聯(lián)合使用。熒光染色技術是評價精子活率的一個有效方法，但是使用熒光染色技術需要配備熒光染色顯微鏡，該儀器較為昂貴，因此限制了該技術的應用。

4 家兔精子質(zhì)膜完整性

精子質(zhì)膜是精子最容易損傷的部位。功能完整的質(zhì)膜是精子新陳代謝，完成獲能、頂體反應以及與透明帶（ZP）結(jié)合并穿過ZP的基礎。因此精子質(zhì)膜是否完整是區(qū)分精子狀態(tài)的一個間接指標，同時也是精子能夠發(fā)生頂體反應的基本條件。目前檢測精子質(zhì)膜的方法主要有3種：低滲腫脹試驗法（HOST）、常規(guī)染色法和熒光探針染色法。

精子質(zhì)膜能夠有選擇地運輸水分子，當質(zhì)膜完整的精子被放到低滲溶液中時，水會進入精子內(nèi)部直至精子胞質(zhì)內(nèi)外環(huán)境達到平衡。由于水的內(nèi)流，精子尾部的質(zhì)膜就要向外周膨脹使精子體積增大、頂體腫脹、尾部彎曲，尤其以尾部彎曲這一特征比較明顯。因此可以用彎尾率作為評價精子質(zhì)膜完整性的指標。據(jù)報道，精子彎尾率與精子獲能率、穿卵率和精子活力顯著相關。此外，劉國世對狐精子進行了檢測，發(fā)現(xiàn)狐精子的HOST與常規(guī)精液品質(zhì)檢測中的活力顯著相關。HOST因具有簡單、迅速和廉價的優(yōu)點，目前已經(jīng)被運用于對兔、馬、狗、牛、羊、小鼠和人等精子質(zhì)膜完整性的檢測。

5 家兔精子頂體完整性

精子頂體是覆蓋于精子核前2/3以上區(qū)域的囊狀結(jié)構(gòu)，囊的內(nèi)外層分別是頂體內(nèi)膜和頂體外膜。頂體內(nèi)富含多種蛋白水解酶，即頂體酶，在精子穿過卵子放射冠和透明帶等受精過程中，頂體酶發(fā)揮著重要作用。精子要穿過透明帶必須有正常的頂體，頂體異常通常伴隨頂體酶質(zhì)和量的改變，故精子頂體完整性與精子功能相關。頂體存在與否常通過染色來判斷。常用的染色方法有考馬斯亮藍染色法、孟加拉玫瑰紅/固綠染色法、巴氏染色法和熒光染色法等。

考馬斯亮藍染色法是評價精子頂體完整性的一種簡單方法，直接染色后就可以在普通光學顯微鏡下觀察。目前評價兔精子的頂體狀態(tài)常用該方法。熒光染色法主要有兩類常規(guī)的熒光探針。一類是金霉素（CTC）以及一些與細胞外抗原結(jié)合的抗體。CTC頂體染色法可客觀地對精子獲能和頂體反應進行定量評價。另一類是外源植物凝集素及一些與精子內(nèi)頂體抗原結(jié)合的抗體，其中的外源植物凝集素常被用來評價頂體的狀態(tài)。檢測中通常將異硫氰熒光素（FITC）與豌豆凝集素（PAS）、花生凝集素（PNA）、伴刀豆凝集素（ConA）結(jié)合使用。在牛和豬精子檢測中，用FTIC-PNA檢測頂體狀態(tài)的結(jié)果與精子直線運動的精子數(shù)、HOST等方法檢測的精子頂體狀況高度相關，而且經(jīng)電子顯微鏡證實，PNA能特異結(jié)合頂體外膜。現(xiàn)在該方法已經(jīng)被用于評價馬、豬、牛、羊和人精子的頂體狀態(tài)。

6 家兔精子染色質(zhì)狀態(tài)

家兔精子核高度致密，其DNA與魚精蛋白緊密結(jié)合，這樣可以將父方遺傳信息準確無誤地導入卵子，繼而傳給后代，因此精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性對于精確傳遞遺傳物質(zhì)至關重要。檢測精子染色質(zhì)完整性常用的方法是PI染色和吖啶橙（AO）染色。

7 家兔線粒體活性

精子的運動能力與線粒體的活性密切相關，線粒體能持續(xù)提供精子運動所需的ATP能量，因此線粒體的活性是評價精子質(zhì)量的一個關鍵指標。檢測精子線粒體活性的熒光探針主要有Rhodamine123（R123）、MITO和JC-1等。R123可檢測線粒體有無功能，但不能區(qū)別線粒體膜電位的高低。MITO在水溶液中并不產(chǎn)生熒光，而當積聚在線粒體內(nèi)時，不論其膜電位如何都會產(chǎn)生綠色熒光。JC-1在線粒體膜電位較高時，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣可方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢查線粒體膜電位的變化，利用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。這些探針常和精子活力探針結(jié)合使用。

8 家兔精子受精能力

通過檢測精子的受精能力可以更準確地評價精子獲能、頂體反應和核去致密化以及受精后胚胎的發(fā)育能力。透明帶是體內(nèi)受精的第一道屏障，在精子和卵子質(zhì)膜融合并進入卵細胞前，精子必須粘附、結(jié)合并穿入透明帶內(nèi)。只有形態(tài)正常的精子才能與透明帶結(jié)合，因此，精子與透明帶的結(jié)合分析能夠準確評價精子的受精能力，這是一種非常有應用前景的檢測方法，但是該方法需要大量的新鮮卵母細胞，這對于大多數(shù)哺乳動物來說都比較困難。第二種方法是把透明帶等份分割后，估計透明帶外表面上結(jié)合的精子數(shù)目，目前已經(jīng)被應用于對人、馬和豬精子受精能力的分析中。第三種方法是利用溶解的透明帶進行分析。此外，體外精子穿入透明帶卵子的能力也常用于檢測精子的受精能力，在同源卵子較難獲得的情況下，該方法多采用去透明帶異種卵子進行分析，目前已經(jīng)用于檢測大多數(shù)哺乳動物和人精子的受精能力，且與其受精能力顯著相關。

9 結(jié)語與展望

體外檢測精子的受精能力和功能狀態(tài)的方法很多。簡便檢測的方法有精子精液量、密度、形態(tài)、活力、活率、常規(guī)染色和HOST，自動和快速檢測的方法有CASA和SQA檢測。科學準確的精液質(zhì)量檢測方法是家兔人工授精和體外受精成功與否的重要因素。隨著精子質(zhì)量檢測技術的發(fā)展，只有將各種檢測設備和探針綜合運用，才能對精子質(zhì)量、受精能力進行科學、準確、快速的評定，這也是本領域發(fā)展的一個必然趨勢。

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