多藥耐藥相關(guān)蛋白-3、4基因在人膽囊膽固醇結(jié)石中表達(dá)的半定量研究

趙家鋒,王建南,吳青松,黃從云,高雙全,張小龍,朱劍華,黃亞麗

(廣東省粵北人民醫(yī)院,1.肝膽外科;2.病理科;3.血液內(nèi)科,廣東韶關(guān),512026)

膽囊結(jié)石是臨床上一種常見病,在我國約80%的膽囊結(jié)石為膽固醇結(jié)石[1]。膽囊結(jié)石長期存在可繼發(fā)膽囊炎、膽管炎、胰腺炎以及膽道腫瘤等,嚴(yán)重影響人們的健康和生活。目前膽囊結(jié)石的形成機制尚未完全明了。膽汁膽固醇過飽和理論認(rèn)為,病人膽汁中膽固醇過多和膽汁酸減少,造成了膽固醇在膽汁中形成過飽和,進而結(jié)晶形成結(jié)石[2]。有研究表明,膽囊結(jié)石患者膽囊上皮細(xì)胞選擇性吸收膽汁膽固醇和磷脂的能力降低[3]。這使得膽汁中的脂類物質(zhì)易于沉積,最終導(dǎo)致結(jié)石的形成。本研究欲通過對人膽囊中MRP3、MRP4基因的檢測,了解其在人膽囊膽固醇結(jié)石形成中可能的作用,分析膽囊膽固醇結(jié)石形成機制,進而為膽囊結(jié)石的形成機制的研究提供證據(jù),并為臨床防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑:一步法RT-PCR試劑盒,購于寶生物工程(大連)有限公司;T RIZOL總RNA提取試劑盒,購于美國Invitrogen公司;100 bp DNA maker和DEPC,購于華美生物技術(shù)工程公司;Tris-base購自美國Promega公司;MRP3、MRP4及B-actin的PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.1.2 0.1%DEPC水的配制:在室溫下(約20℃)將DEPC(焦碳酸二乙酯)2 mL溶于1 998 mL三蒸水中,經(jīng)磁力攪拌器攪拌30 min使其充分溶解。

2 實驗方法

2.1 標(biāo)本選擇

2.1.1 實驗組的選擇:實驗組所選用的30例患膽固醇結(jié)石人膽囊組織標(biāo)本,為2009年4月～2010年9月因“膽囊結(jié)石”在本院行“LC(腹腔鏡膽囊切除術(shù))”后的手術(shù)標(biāo)本,所入選的病例均經(jīng)實驗證實為膽囊結(jié)石為膽固醇結(jié)石(方法見后述),入選者無血脂異常,無病毒性肝炎病史等其他合并癥;不伴有肝內(nèi)膽管及膽總管結(jié)石。入選病經(jīng)手術(shù)切除膽囊后,于無菌條件下用滅菌的生理鹽水清洗膽囊標(biāo)本后,立即置于液氮冷凍,并及時轉(zhuǎn)入-70℃低溫冰箱保存。

2.1.2 膽囊膽固醇結(jié)石的鑒定方法:將手術(shù)所得到的膽囊結(jié)石標(biāo)本在室溫下風(fēng)干,研成粉末狀,取粟粒大小的膽結(jié)石粉末置于凹瓷板中,先加入醋酸酐5～6滴,再加入濃硫酸1滴。如溶液呈翠綠色,則為膽固醇結(jié)石。呈紅星芒以膽結(jié)石粉末為中心向四周放射者,為膽色素結(jié)石則排除在實驗之外。

2.1.3 對照組的選擇:對照組8例無結(jié)石人膽囊標(biāo)本來源于2009年5月～2009年9月在中山大學(xué)附屬三院肝移植中心行肝臟移植手術(shù)中供體的膽囊,這些病例術(shù)前經(jīng)各項實驗室檢查確定無血脂異常,無病毒性肝炎病史等其他合并癥;亦無肝內(nèi)外膽管及膽囊結(jié)石。

2.2 提取總RNA

按Trizol試劑盒說明書要求對所有標(biāo)本組織進行總RNA抽提。RNA樣品用752紫外分光光度計法測定D260nm和D280nm(D260nm/D280nm≥1.8),計算所得到的 RNA樣品的濃度和純度。所用器材均予滅活RNA酶處理。

2.3 RT-PCR檢測MRP3、MRP4 mRNA 的表達(dá)

2.3.1 引物的設(shè)計與合成:MRP3的引物設(shè)計參照文獻[4],并經(jīng)基因庫核對證實;內(nèi)參MRP4與beta actin的引物的設(shè)計是通過網(wǎng)址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov進入Genbank數(shù)據(jù)庫,查找人的MRP4和beta actin基因的mRNA的全基因序列,根據(jù)其序列應(yīng)用Primer premier5.0軟件進行引物設(shè)計;引物合成委托上海生物工程公司完成,引物序列為:

①MRP3(擴增產(chǎn)物長度452bp)

forward:5′-GGGACCCTGCGCATGAACCTG-3′

reverse:5′-GGCAAGTCCAGCATCTCTGG-3′

②MRP4(擴增產(chǎn)物長度305bp)

forward:5′-ACGGATGAGGAACTGTGGAAT-3′

reverse:5′-TTGTCGCTGTCAATAATGGTG-3′

③beta actin(擴增產(chǎn)物 174bp,內(nèi)參照)

forward:5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3′

reverse:5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′

2.3.2 RT-PCR:按照寶生物公司的 RTPCR一步法檢測試劑盒說明書(批號DRR024A)操作(本實驗中將MRP3與MRP4分兩個體系進行,以免引物間相互影響)。

2.3.3 電泳和圖像分析:取PCR產(chǎn)物,于2%瓊脂糖凝膠上(含0.5 μ g/mL EB)進行電泳,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。圖片經(jīng)掃描儀掃描后,用凝膠成像系統(tǒng)自帶的Sigma Scan Pro 5圖像分析軟件進行光密度積分值分析,分別計算各標(biāo)本的 MRP3、MRP4各自與 beta actin(內(nèi)參物)的光密度積分值之比 ,以此作為MRP3或MRP4表達(dá)的相對含量值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗所得數(shù)據(jù)為目的基因擴增后電泳條帶的灰度值與內(nèi)參beta actin灰度值的比值,為計量資料,使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計描述,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。當(dāng)總體方差齊同時用t-test進行統(tǒng)計學(xué)分析;當(dāng)方差不齊時,選用Satterthwaite法分析。樣本均數(shù)之間的統(tǒng)計分析用 t檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

本實驗結(jié)果表明,在正常膽囊組織中,僅有MRP3表達(dá),而未能檢測到MRP4表達(dá)。MRP3和MRP4在患膽固醇結(jié)石的膽囊組織中同時表達(dá),而且表達(dá)水平均顯著高于正常膽囊(P<0.001),且MRP3的表達(dá)水平顯著高于MRP4(P<0.001)。

3.1 實驗組與對照組MRP3表達(dá)的比較

經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)自帶的灰度分析系統(tǒng)進行灰度分析,所得數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析(t-test),MRP3條帶的灰度強于對照組MRP3條帶的灰度(P<0.001)。

3.2 實驗組與對照組MRP4表達(dá)的比較

經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)自帶的灰度分析系統(tǒng)進行灰度分析,在患有膽固醇結(jié)石的膽囊標(biāo)本中檢測到MRP4的表達(dá)。因在正常膽囊中未檢測到MRP4基因的表達(dá),故將所得到的MRP4的灰度(相對內(nèi)參)值與0進行統(tǒng)計學(xué)對比,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

3 實驗組膽囊組織中MRP3和MRP4的表達(dá)情況

經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)進行灰度分析,MRP3條帶的灰度強于MRP4的灰度。將所得的灰度值經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析顯示,兩者的差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

4 討 論

MRP家族有9個成員(MRP1-9)[5-7],屬于ABC轉(zhuǎn)運家族的一個亞族[8]。已知MRP家族中的成員可以轉(zhuǎn)運不同的底物,包括各種抗腫瘤藥物、硫酸鹽、葡萄糖醛酸苷、或者谷光苷肽等到的化合物,以及環(huán)肽、一磷酸核苷酸、環(huán)核苷酸等[9]。

已有研究發(fā)現(xiàn),正常情況下在肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的基底外側(cè)膜有MRP3表達(dá)[10-11],其功能可能是在介導(dǎo)有機陰離子從肝內(nèi)排泌入血液[5]。它可以轉(zhuǎn)運單價(如?；撬岷透拾彼崮懰猁})和二價的膽汁酸鹽(例如?；鞘懰岬牧蛩猁}和?；蛆Z脫氧膽酸的硫酸鹽)以及葡萄糖醛酸苷的化合物[12-13]。在膽汁淤積和高膽紅素血癥(結(jié)合與非結(jié)合膽紅素升高)時其表達(dá)可以上調(diào)[14]。

有研究表明,MRP4的底物亦較為廣泛,可以運載硫酸類固醇和膽汁酸的硫酸鹽[15],還可以轉(zhuǎn)運環(huán)核苷酸和核苷酸類似物[16-17]。有研究指出,正常情況下的肝臟,MRP4表達(dá)量較低[18]。然而提高肝細(xì)胞的膽汁酸鹽濃度可以使MRP4在肝內(nèi)的表達(dá)上調(diào)[19]。提示Mrp4在對有毒的膽汁酸的化合物的排泌過程中發(fā)揮作用。

在ABC轉(zhuǎn)運體家族中的MRP亞家族中,MRP4是獨一無二的雙重定位,即它可以隨不同的組織和細(xì)胞而出現(xiàn)不同的表達(dá)定位。MRP4既可定位于細(xì)胞頂端膜,在這些地方它將底物定向地向管腔內(nèi)轉(zhuǎn)運。亦可定位于基底外側(cè)膜,以阻止底物從管腔內(nèi)向外轉(zhuǎn)運。推測MRP4在極性細(xì)胞的這種定位可能對一些獨特而重要的陰離子底物的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用[20]。

關(guān)于MRP3、MRP4在膽囊膽固醇結(jié)石形成過程中的具體作用,作者認(rèn)為,在膽囊上皮組織中,MRP3定位于上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜,其作用是將膽汁中的膽酸鹽重吸收而排泌入膽管和膽囊周圍的血管叢。而對于MRP4而言,可能它既在膽囊上皮的頂端表達(dá)同時也在膽囊皮細(xì)胞的的基底外側(cè)膜表達(dá),在這些不同的部位,發(fā)揮不同的作用:在頂端膜,它可能是將膽固醇排泌入膽囊內(nèi)的膽汁;而在基底外側(cè)膜,它卻將膽酸鹽排向血液。這兩方面的作用將導(dǎo)致膽汁中膽固醇的濃度升高,同時膽汁酸鹽的濃度卻降低,其最終結(jié)果將使膽汁中的膽固醇易于結(jié)晶,進而促進膽固醇結(jié)石的形成。

綜上所述,作者認(rèn)為MRP3、MRP4在膽囊膽固醇結(jié)石患者的膽囊組織中同時表達(dá),并且表達(dá)水平較無結(jié)石患者均升高,因而認(rèn)為它們共同導(dǎo)致膽囊內(nèi)已經(jīng)濃縮的膽汁中的膽酸鹽濃度進一步降低,同時卻使得膽固醇的濃度進一步升高,進而認(rèn)為MRP3、MRP4在膽汁酸鹽的排泌中起重要作用,與膽囊膽固醇結(jié)石的形成有關(guān),即促進膽囊膽固醇結(jié)石的形成。

(致謝:衷心感謝中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝移植中心為本研究提供的對照組標(biāo)本及在此過程中提供的幫助)

[1]裘法祖.外科學(xué)[M].第4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1997:551.

[2]韓天權(quán),張圣道.膽囊結(jié)石的成因研究進展[J].新醫(yī)學(xué),1994,25(5):230.

[3]Afdhal N H,Niu N,Gantz D,et al.Bovine gallbladder mucin accelerates cholesterol monohydrate crystal growth in model bile[J].Gastroenterology,1993,104(5):1515.

[4]Rost D,Knig J,Weiss G,et al.Expression and localization of the multidrug resistance proteins MRP2 and M RP3 in human gallbladder epithelia[J].Gastroenterology,2001,121(5):1203.

[5]Borst P,Evers R,Kool M,et al.A family of drug transporters:the multidrug resistance-associated proteins[J].J Natl Cancer Inst,2000,92(16):1295.

[6]Renes J,de Vries E G,Jansen P L,et al.The(patho)physiological functions of the M RP family[J].Drug Resist Updat,2000,3(5):289.

[7]Tammur,J,Prades,I C.Rzhetsky Arnould,et al.Two new genes from the human ATP-binding cassette transporter superfamily,ABCC11 and ABCC12,tandemly duplicated on chromosome 16q12[J].Gene,2001,273:89.

[8]Dean M,Rzhetsky A,Allikmets R.The Human ATPBinding Cassette(ABC)TransporterSuperfamily[J].GENOME RESEARCH,2001,11(7):1156.

[9]Zelcer N,Saeki T,Reid G,et al.Characterization of Drug Transport by the Human Multidrug Resistance Protein 3(ABCC3)[J].J Biol Chem,2001,276(49),46400.

[10]Donner M G,Keppler D.Up-regulation of basolateral multidrug resistance protein 3(M RP3)in cholestatic rat liver[J].Hepatology,2001,34:351.

[11]Soroka C J,Lee J M,Azzaroli F,et al.Cellular localization and up-regulation of multidrug resistance-associated protein 3 in hepatocytes and cholangiocytes during obstructive cholestasis in rat liver[J].Hepatology,2001,33:783.

[12]Hirohashi T,Suzuki H,Takikawa H,et al.ATP-dependent transport of bile salts by rat multidrug resistance-associated protein 3(M RP3)[J].J Biol Chem,2000,275:2905.

[13]Hirohashi T,Suzuki H,Sugiyama Y.Characterization of the transport properties of cloned rat multidrug resistance-associated protein 3(MRP3)[J].J Biol Chem 1999,274:15181.

[14]Hirohashi T,Suzuki H,Ito K,et al.Hepatic expression of multidrug resistance-associated protein-like proteins maintained in Eisai hyperbilirubinemic rats[J].Mol Pharmacol,1998,53:1068.

[15]Assem M,Schuetz E G.,Leggas M,et al.Interactions between Hepatic M rp4 and Sult2a as Revealed by the Constitutive Androstane Receptor and M RP4 Knockout Mice[J].J.Biol.Chem,2004,279(21):22250.

[16]Schuetz J D,Connelly M C,Sun D,et al.M RP4:A previously unidentified factor in resistance to nucleoside-based antiviral drugs[J].Nat Med,1999,5:1048.

[17]Chen Z S,Lee K,Kruh G D.Transport of cyclic nucleotides and estradiol 17-beta-D-glucuronide by multidrug resistance protein 4.Resistance to 6-mercaptopurine and 6-thioguanine[J].J Biol Chem,2001,276:33747.

[18]Kool M,de Haas M,Scheffer G L,et al.Analysis of expression of cMOAT(M RP2),MRP3,MRP4,and M RP5,homologues of the multidrug resistance-associated protein gene(MRP1)in human cancer cell lines[J].Cancer Res,1997,57:3537.

[19]Schuetz E G,Strom S,Yasuda K,et al.Disrupted bile acid homeostasis reveals an unexpected interaction among nuclear hormone receptors,transporters,and cytochrome p450[J].J Biol Chem,2001,276:39411.

[20]Leggas M,Adachi M,Scheffer G L,et al.M rp4 Confers Resistance to Topotecan and Protects the Brain from Chemotherapy[J].Molecular andCellular Biology,2004,24(17):7612.