赤雹根總皂苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾淋巴細(xì)胞及腹腔巨噬細(xì)胞的影響

陳建雙，張玉玲，李莎莎，佟繼銘，劉永平

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性、全身性、自身免疫性疾病，以多關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和功能障礙為主要特征，目前尚無有效控制疾病發(fā)展的理想藥物。赤雹根總皂苷(SRTD)為滿藥赤雹成熟干燥塊根的正丁醇萃取物，是赤雹根的主要有效成分之一，有明顯的鎮(zhèn)痛作用［1］，但其能否用于RA的治療目前未見報道。我們于2009年1月～2010年2月進(jìn)行本研究，擬探討SRTD對佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠的治療作用機(jī)制，為赤雹根的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1．2 藥品與試劑 SRTD由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所藥理毒理研究室制備;弗氏不完全佐劑(FIA)、脂多糖(LPS)、刀豆蛋白 A(ConA)、MTT，美國 Sigma公司;卡介苗(BCG)，衛(wèi)生部北京生物制品研究所;IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒，武漢博士德生物科技有限公司;RPMI 1640干粉，Gibco公司;胎牛血清，杭州四季青公司;淋巴細(xì)胞分離液，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。

1．3 AA模型制備及分組 取大鼠80只，隨機(jī)取10只作為正常對照組(NC組)，注射等體積蒸餾水。其余70只大鼠每只右后足跖皮內(nèi)注射0．1 ml弗氏完全佐劑(FCA，BCG濃度為12 mg/ml)，以注射點周圍出現(xiàn)明顯的突起白泡為佳。致炎后第18天采用關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)評分法計算關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)值［2］，AI值≥6為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。本組大鼠成模率為75．7%(53/70)。將造模成功的53只大鼠隨機(jī)分為模型組(Model組)，SRTD 160、80、40 mg/(kg·d)組和雷公藤12 mg/(kg·d)組(TP組)，每組10只，各組大鼠連續(xù)灌胃給藥21 d，給藥量為10 ml/(kg·d)，NC組和 Model組灌胃給予等體積的SRTD溶劑蒸餾水。剩余3只不做任何處置，觀察其自然病程。

1．4 脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)測定 用藥后第22天，頸椎脫臼處死大鼠，常規(guī)方法制備大鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸浮于RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，用臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)在95%以上后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml。于96孔培養(yǎng)板中每孔加入細(xì)胞懸液200 μl，每一樣品加6 孔，其中3 孔各加10 μl ConA液作為平行試驗孔，另3孔作為對照孔，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h 每孔輕輕吸去上清液 150 μl，補(bǔ)加 150 μl不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，同時加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，于振蕩器上混勻后置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，置振蕩器上混勻后靜置20 min，使紫色結(jié)晶完全溶解，取上清液150 μl于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，570 nm處用酶標(biāo)儀測OD值，計算脾細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)。PI=(實驗孔OD值－對照孔OD值)/對照孔OD值。

1．5 腹腔巨噬細(xì)胞(PMΦ)IL-1β、TNF-α 的誘生與檢測 用藥后第22天，頸椎脫臼處死大鼠，常規(guī)方法制備大鼠PMΦ懸液，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml。取細(xì)胞懸液于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml。置CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)2～3 h，使PMΦ貼壁。取出培養(yǎng)板棄去上清，用RPMI 1640洗滌培養(yǎng)板3遍即得巨噬細(xì)胞單層。于單層巨噬細(xì)胞孔中加入LPS(20 μg/ml)1 ml。置CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h，收集上清液過濾除菌，－20℃保存，采用雙抗夾心ABC-ELISA法測定IL-1β、TNF-α 含量。

2 結(jié)果

2．1 脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果 NC組、Model組、160 mg/(kg·d)SRTD 組、80 mg/(kg·d)SRTD 組、40 mg/(kg·d)SRTD組、TP組大鼠PI值分別為0．23±0．03、0．87 ± 0．01、0．34 ± 0．03、0．53 ± 0．02、0．60 ±0．02、0．23 ±0．02，各組與 Model組比較 P 均 ＜0．01。

2．2 IL-1β、TNF-α 檢測結(jié)果 NC 組、Model組、160 mg/(kg·d)SRTD 組、80 mg/(kg·d)SRTD 組、40 mg/(kg·d)SRTD組、TP組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β 分別為(0．09 ±0．02)、(0．41 ±0．03)、(0．11 ±0．02)、(0．15 ±0．02)、(0．22 ±0．02)、(0．13 ±0．03)ng/ml，各組與 Model組比較 P 均 ＜0．01;產(chǎn)生 TNF-α分別為(0．17 ±0．01)、(1．24 ±0．06)、(0．18 ±0．01)、(0．26 ±0．01)、(0．32 ±0．01)、(0．20 ±0．01)ng/ml，各組與Model組比較P均＜0．01。

3 討論

AA為免疫性炎癥模型，是篩選和研究治療RA藥物常用的模型之一［7］，其組織病理學(xué)變化和發(fā)病機(jī)制與人類RA相似。前期實驗證實，SRTD能明顯改善大鼠的多關(guān)節(jié)炎癥狀，使動物活動增多、關(guān)節(jié)腫脹度和AI顯著下降，提示SRTD對RA有一定的治療作用。

細(xì)胞免疫功能紊亂是AA大鼠免疫功能異常的重要特征之一。ConA作為多克隆刺激劑可選擇性刺激T細(xì)胞增殖。實驗結(jié)果顯示，AA模型組大鼠PI明顯高于正常對照組，與文獻(xiàn)報道一致［3］。SRTD對AA大鼠過度增強(qiáng)的脾T淋巴細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，提示SRTD對大鼠AA的治療作用與抑制T淋巴細(xì)胞增殖有關(guān)。

細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，促炎因子(IL-1、IL-6、TNF-α)增多，抗炎因子(IL-10)減少，在RA的發(fā)病中亦起著非常重要的作用［4］。IL-1β、TNF-α 均是 RA 的促炎細(xì)胞因子，IL-1與TNF-α有許多相似的促炎癥作用而被稱為“姊妹細(xì)胞因子”［5］，且均與RA疾病活動相關(guān)。IL-1能促進(jìn)體內(nèi)淋巴細(xì)胞和骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖和分化、促進(jìn)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成并釋放前列腺素PGE2和膠原酶［6］，后者可進(jìn)一步引發(fā)滑膜的炎癥反應(yīng)，造成軟骨基質(zhì)的崩解，抑制糖蛋白及骨的合成，造成關(guān)節(jié)損傷。而局部免疫復(fù)合物、游離膠原等分解產(chǎn)物刺激 IL-1合成，這樣就形成惡性循環(huán)。IL-1還可刺激B型滑膜細(xì)胞產(chǎn)生高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶，降解大多數(shù)的細(xì)胞外基質(zhì)成分，加快RA的破壞性進(jìn)程。TNF-α具有許多與IL-1相似的作用，可刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成PGE2和膠原酶，引起骨和軟骨的吸收破壞，促進(jìn)成纖維母細(xì)胞的增生。TNF-α在活動性 RA中還可提高血小板的活性和聚集。

文獻(xiàn)報道在 RA患者的滑液和血清中 IL-1、TNF-α水平均明顯增高［7］。本研究結(jié)果表明，AA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β、TNF-α含量明顯升高，不同劑量的SRTD可不同程度下調(diào)促炎細(xì)胞因子水平以恢復(fù)細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)平衡，這可能是SRTD治療RA的機(jī)制之一。

［1］張玉玲，趙波，陳建雙，等．赤雹根鎮(zhèn)痛作用及有效部位研究［J］．時針國醫(yī)國藥，2010，21(10):2483-2484．

［2］佟麗，辛增輝，陳育堯，等．Mtb誘導(dǎo)的SD大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的建立及評價［J］．中國藥理學(xué)通報，2009，25(2):259-263．

［4］田俊閣，盧偉偉，平立峰．中藥對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠細(xì)胞因子影響的研究進(jìn)展［J］．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18(30):3774-3776．

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［7］肖金魚，王炳勝，王書杰．IL-1及TNF-α在關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清中表達(dá)的實驗研究［J］．中國中醫(yī)急癥，2011，20(4):607-608．