豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究進(jìn)展

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豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究進(jìn)展

遲 蘭 汪鵬旭 丁文衛(wèi)（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇徐州 221006）

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的接觸性傳染病，主要引起懷孕母豬后期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎增多，仔豬出現(xiàn)呼吸道癥狀和斷奶前死亡率增高。該病最早于1987年發(fā)生于美國(guó)的北卡羅納、衣阿華等州，隨后在短短的幾年時(shí)間內(nèi)，迅速遍及全球各養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家和地區(qū)(北美洲，1987；歐洲，1990；亞洲，1991)。1991年，荷蘭科學(xué)家Wensvoort 博士首次從感染豬體內(nèi)分離到該病毒，并命名為L(zhǎng)elystad病毒(LV)，1992年美國(guó)研究人員用CL2621細(xì)胞也分離到PRRSV，并命名為VR-2332毒株[1]。雖然世界各地所分離的PRRSV可引起類(lèi)似的癥狀，但根據(jù)資料顯示，PRRSV在毒力性、抗原性以及遺傳性方面均有很大的差異，根據(jù)基因序列以及抗原性差異，將PRRSV分為A、B兩個(gè)亞群。A亞群即以LV為代表的歐洲型毒株，B亞群即以VR-2332株為代表的美洲型毒株。二者的基因組核苷酸一致性僅55%~70%，但其形態(tài)結(jié)構(gòu)、復(fù)制特點(diǎn)、細(xì)胞嗜性、流行傳播方式及其引發(fā)的疾病特征等生物學(xué)特性均相同。目前亞洲的日本、韓國(guó)、菲律賓等國(guó)也有該病報(bào)道。1995年國(guó)內(nèi)某些豬場(chǎng)發(fā)生流產(chǎn)、死胎等繁殖疾病，1996年哈爾濱獸醫(yī)研究所在國(guó)內(nèi)首次分離到PRRSV，證實(shí)本病在國(guó)內(nèi)存在[2]。

1 PRRSV的一般特性

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)為不分節(jié)段、聚腺苷酸化、有囊膜的正鏈單股RNA病毒，屬于尼多病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬。成熟的病毒粒子直徑約50~72nm，核衣殼直徑約20~30nm，呈20面體對(duì)稱(chēng)。在蔗糖中的浮密度為1.13~1.15g/ml，在氯化銫中的浮密度為1.18~1.19g/ml，本病毒不能凝集豬、羊、牛、鼠、馬、鴨、雞以及人O型紅細(xì)胞。PRRSV對(duì)溫度敏感，-20℃以下可長(zhǎng)期保存，4℃以上保存一周后感染性喪失90%，但30d后仍可檢出有感染性的病毒粒子。將PRRSV陽(yáng)性血清保存于25℃環(huán)境中，24h后病毒分離率為47%，48h后分離率下降到14%，而72h后分離率僅為7%，因此，在進(jìn)行病毒分離時(shí)，病料必須在低溫下保存和運(yùn)輸。PRRSV對(duì)pH值敏感，在pH低于6.0或高于7.5時(shí)，很快喪失活力。病毒粒子對(duì)乙醚、氯仿等脂溶劑也非常敏感[3]。囊膜破壞后，其核心粒子無(wú)感染性。

2 PRRSV的分子生物學(xué)特性

2.1 PRRSV的復(fù)制特性 PRRSV基因組全長(zhǎng)約15kb，有8個(gè)開(kāi)放性閱讀框架(ORFs)，基因組5’端有一段非編碼區(qū)5’NCR序列，隨后是復(fù)制酶基因ORF1a、ORF1b和結(jié)構(gòu)蛋白基因ORF2-7、以及3’非編碼區(qū)和Poly(A)結(jié)構(gòu)。其中ORF1a、1b占整個(gè)基因組的75%以上。大多數(shù)ORF之間形成長(zhǎng)短不一的部分重疊。PRRSV基因組RNA通過(guò)不連續(xù)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制產(chǎn)生一系列的亞基因組mRNA，這些亞基因組mRNA的5’端都具有一個(gè)來(lái)自于基因組RNA 5’NCR的共同的前導(dǎo)序列，并且形成一個(gè)共3’端的嵌套式結(jié)構(gòu)，這也正是尼多病毒目的特征。

2.2 病毒基因組編碼的蛋白質(zhì) PRRSV基因組編碼的蛋白有復(fù)制酶、聚合蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。ORF1編碼復(fù)制酶和聚合蛋白，是唯一的非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的復(fù)制。ORF1a編碼的聚合蛋白經(jīng)裂解后產(chǎn)生6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1α，NSP1β和NSP2~5)。其中NSP2的氨基酸序列在美洲株和歐洲株之間的同源性僅有32%，實(shí)驗(yàn)表明NSP2基因中含有B細(xì)胞表位免疫的優(yōu)勢(shì)基因；NSP1α和NSP1β包含兩個(gè)類(lèi)木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶區(qū)。ORF1b編碼的聚合蛋白長(zhǎng)約1463個(gè)氨基酸，被ORF1a編碼的蛋白酶切割后形成RdRp、CP2、CP3、CP4個(gè)蛋白。

GP2為結(jié)構(gòu)糖蛋白，由ORF2編碼，分子量為29~30kDa，有兩個(gè)明顯的疏水峰和糖基化位點(diǎn)，LV的GP2能整合入病毒粒子中。GP2肽鏈內(nèi)含有二硫鍵，通過(guò)二硫鍵可和其他結(jié)構(gòu)蛋白形成同源或異源多聚體，其糖基化位點(diǎn)被N-聚糖復(fù)合物覆蓋。GP2蛋白表面有一個(gè)抗原位點(diǎn)，其周?chē)幸粋€(gè)VSRRIYQ基元，可與GP5蛋白B細(xì)胞抗原位點(diǎn)構(gòu)成二級(jí)結(jié)構(gòu)。GP2蛋白免疫原性很差，在病毒中含量較少，很難從感染的細(xì)胞裂解液或純化的病毒粒子中得到分離鑒定。

GP3為高度糖基化蛋白，具有7個(gè)糖基化位點(diǎn)，分子量為40~50kDa，含265個(gè)氨基酸?，F(xiàn)在對(duì)GP3是否為結(jié)構(gòu)蛋白尚無(wú)定論。GP3蛋白羧基端有一個(gè)與病毒血清型有關(guān)的非中和抗原表位，其可能引起病毒基因型抗原性的差異。GP3是PRRSV各毒株間保守性最差的蛋白之一，在歐、美型毒株間推導(dǎo)氨基酸的同源率為54%~60%，而且多數(shù)變異發(fā)生在N末端。Duran等人用桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)了PRRSV ORF3的產(chǎn)物，表達(dá)產(chǎn)物可給豬提供68.4%的保護(hù)率，說(shuō)明ORF3表達(dá)產(chǎn)物在抵抗病毒感染時(shí)具有一定作用。

GP4蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，分子量約為31~35kDa，有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，其N(xiāo)端和C端有高度的疏水區(qū)。該蛋白氨基端有一信號(hào)肽序列，在GP4蛋白胞外區(qū)第40~79位氨基酸之間有一個(gè)可與單抗發(fā)生中和反應(yīng)的抗原決定簇，該區(qū)域在不同的PRRSV中高度可變，它可能與免疫選擇有關(guān)。

GP5為糖基化的囊膜蛋白，又稱(chēng)E蛋白，分子量約為26~30kDa，含4個(gè)糖基化位點(diǎn)和一段31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，該蛋白含有一段很大的內(nèi)部疏水區(qū)。E蛋白與M蛋白在囊膜內(nèi)由二硫鍵結(jié)合成異源二聚復(fù)合物，其內(nèi)含有與病毒有關(guān)的免疫重要區(qū)。GP5有6個(gè)抗原決定簇，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，另有報(bào)道，GP5可誘導(dǎo)并引發(fā)細(xì)胞凋亡。

ORF6編碼非糖基化蛋白，也稱(chēng)M蛋白，分子量為18~19kDa。VR-2332型和LV型分別含有174和173個(gè)氨基酸。M蛋白的N端有3個(gè)疏水性跨膜區(qū)，針對(duì)該蛋白的單抗從歐洲和北美洲的分離株中識(shí)別出2個(gè)共同和1個(gè)獨(dú)特的抗原決定簇。M蛋白在所有的PRRSV株間高度保守，在歐、美型毒株間也最為保守。通過(guò)感染豬康復(fù)血清的Western免疫印跡試驗(yàn)證明了M蛋白具有很強(qiáng)的免疫性，感染后10d就可以檢測(cè)該抗體應(yīng)答。表達(dá)重組的M蛋白可作為血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的靶抗原。

ORF7編碼核衣殼(N)蛋白，分子量為13.8~15kDa，堿性，親水性，具有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，但非糖基化蛋白。北美洲型和歐洲型分離株分別含有123個(gè)和128個(gè)氨基酸。N蛋白有6個(gè)疏水區(qū)及至少5個(gè)抗原決定簇，其中既有對(duì)所有毒株保守的共同決定簇，又有北美洲各型和歐洲各型的特異性決定簇。N蛋白在病毒粒子中含量較高，約占病毒蛋白總量的20%~40%，具有較高的免疫原性。通過(guò)Western-blot證明豬感染PRRSV后最早出現(xiàn)(大約7d)的是針對(duì)N蛋白的抗體，且該抗體可持續(xù)存在半年以上，因此N蛋白可作為PRRSV抗體的檢測(cè)抗原，無(wú)論早期還是晚期都有重要的診斷學(xué)意義；但此抗體為非中和抗體，對(duì)機(jī)體無(wú)保護(hù)作用，無(wú)免疫學(xué)價(jià)值[4]。

3 PRRSV的遺傳變異

PRRSV各毒株之間，尤其是歐洲分離株與北美分離株之間存在很大的差異。盡管不同PRRSV分離株引起同一疾病，但用多克隆抗血清或單克隆抗體進(jìn)行的血清學(xué)試驗(yàn)證實(shí)毒株之間存在顯著的抗原多樣性，這可能是由于結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸出現(xiàn)廣泛變異所致。

北美洲型毒株之間也存在廣泛的差異。Andreyev等分析了分離自美國(guó)、加拿大和危地馬拉的22株P(guān)RRSV ORF5序列，它們與VR-2332 ORF5編碼氨基酸的同一性在89%~94%之間，其中還有兩株只有2個(gè)(大多數(shù)是3個(gè))糖基化位點(diǎn)。因此，有人將北美洲型進(jìn)一步劃分為3個(gè)亞型。

Yoon等用5種針對(duì)核衣殼蛋白的單抗評(píng)價(jià)了1989~1993年間分離自美國(guó)22株分離物之間的抗原關(guān)系，根據(jù)其反應(yīng)性不同而將其劃分為3群。Yang等曾經(jīng)用23種單抗將美國(guó)1989~1995年間分離的70株病毒分為5群，抗原變異歸因于群特異性的單堿基置換，LV迥異于北美洲分離株而成為一個(gè)獨(dú)特的抗原群。Drew等用6種針對(duì)核衣殼蛋白的單抗對(duì)25株歐洲分離株間的抗原關(guān)系進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)歐洲毒株也存在抗原變異。

對(duì)基因組的基因序列分析比較從分子遺傳學(xué)上闡釋了血清學(xué)試驗(yàn)所證實(shí)的抗原多樣性[4]。ORF7是極為保守的病毒基因，北美洲毒株間ORF7氨基酸同一性高達(dá)95%~100%，而與歐洲型毒株間ORF7氨基酸同一性只有57%~59%；ORF6是北美洲毒株與歐洲型毒株間最為保守的病毒基因，氨基酸同一性可達(dá)70%~81%；ORF2-4氨基酸同一性分別為91%~99%、86%~98%和92%~99%[5]。這些證據(jù)表明，PRRSV分離株可區(qū)分成兩種不同的基因型，即歐洲型(代表毒株為L(zhǎng)V)和北美洲型(代表毒株為VR-2332)。歐洲地區(qū)主要流行歐洲型，而美洲和亞太地區(qū)則以后者為主要毒型。

不同分離株對(duì)不同階段的妊娠母豬的致病性差別很大，這表明各毒株在毒力上有所不同。有的豬群已發(fā)生PRRS血清學(xué)陽(yáng)轉(zhuǎn)，卻沒(méi)有明顯的繁殖障礙，這可能是由于該毒株對(duì)生殖系統(tǒng)的毒力已經(jīng)減弱造成的。隨著病毒與宿主和環(huán)境的相互作用而具有不同的毒力特征，這有助于解釋現(xiàn)地常見(jiàn)的亞臨床感染現(xiàn)象。

4 中國(guó)PRRSV分子生物學(xué)研究

4.1 分子克隆 蔡家利等[6]克隆了PRRSV美國(guó)弱毒疫苗株P(guān)RMV株ORF6和ORF7，并進(jìn)行了序列測(cè)定和比較。仇華吉等[7]克隆了CH-1a株的全部結(jié)構(gòu)蛋白基(ORF2-ORF7)。研究表明，主要免疫原性基因ORF3和ORF5的體外表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，因此ORF3和ORF5的分子克隆為下一步構(gòu)建重組疫苗或者基因疫苗奠定了基礎(chǔ)。ORF7編碼的保守性核衣殼蛋白是PRRSV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，它是現(xiàn)代血清學(xué)試驗(yàn)的抗原基礎(chǔ)，具有診斷學(xué)意義，克隆ORF7是研制重組抗原的必要前提。

4.2 序列測(cè)定與分析 姜平等[8]擴(kuò)增了華東和華北分離株的ORF5、ORF6和ORF7，并測(cè)定了序列，與VR-2332株核苷酸同一性均為99%，同源性如此之高是PRRSV罕見(jiàn)的。姜平等對(duì)華東和華北分離株ORF5-7也進(jìn)行了序列分析。仇華吉等測(cè)定了CH-1a株ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7的核酸序列，并與國(guó)外參考毒株序列進(jìn)行了比較分析。CH-1a株ORF2與美洲型標(biāo)準(zhǔn)毒株VR-2332株和歐洲型株毒株LV株核苷酸同一性分別為95.3%和64.2%，氨基酸的同源性為95.3%和62.9%；CH-1a株ORF3與VR-2332株還有LV株核苷酸同一性為91.5%和65.3%，氨基酸的同源性分別為88.6%和61.9% ；ORF4與VR-2332株還有LV株核苷酸同一性91.6%和63.5%，氨基酸的同源性分別為92.1%和70.5%；ORF5與VR-2332株還有LV株核苷酸同一性為92%和65.4%，氨基酸的同源性分別為93%和61%；ORF6與VR-2332株還有LV株核苷酸同一性為94.9%和70.2%，氨基酸的同源性分別為97%和81%；ORF7與VR-2332株、IAF-exp01株(加拿大參考毒株)和LV株核苷酸同一性為94.6%、93%和66.1%，氨基酸的同源性分別為97.6%、97%和68.8%。根據(jù)ORF5和ORF7繪制的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)表明CH-1a株與VR-2332株可能來(lái)源于同一祖先。利用有關(guān)軟件分析了ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7編碼產(chǎn)物的等電點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、疏水性、抗原性和有關(guān)位點(diǎn)，積累了PRRSV分子生物學(xué)和分子流行病學(xué)資料。

4.3 體外表達(dá) 仇華吉等利用原核表達(dá)系統(tǒng)高校表達(dá)了CH-1a株ORF7，表達(dá)產(chǎn)物具有特異性免疫活性，為重組診斷抗原的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。ORF5的真核表達(dá)質(zhì)粒和ORF7的桿狀病毒載體也已經(jīng)構(gòu)建成功，表達(dá)蛋白的研制和應(yīng)用正在進(jìn)行中。

[1] Collins JE, Benfield DA, Vhristianson WT, et al. Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of disease in gnotobiotic pigs. J. Vet. Diagn. Invest.1992, 4:117-126.

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[6] 蔡家利,姜平,蔡寶祥,馬志勇. 豬繁殖和呼吸綜合征病毒基質(zhì)膜蛋白和核衣殼蛋白基因的克隆與鑒定. [J]中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 1999(1).

[7] 仇華吉, 郭寶清, 童光志等.豬繁殖-呼吸綜合征病毒CH-Ia株基因型鑒定[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào).1998, 18(2): 118-121.

[8] 姜平, 陳溥言, 蔡寶祥. 豬繁殖和呼吸綜合征病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 1998(12).

S858.28

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1007-1733(2011)01-0064-03

（2010–11–21）