柴胡有效成分提取分離方法的研究進(jìn)展

陳 朝,伍小燕

(廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,廣西南寧,530023)

柴胡為傘形科柴胡屬植物柴胡.或狹葉柴胡的根,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,原名茈胡、地薰,列為上品,宋代《圖經(jīng)本草》始易其名為柴胡[1]。其味苦,性微寒。具和解表里、疏肝、升陽(yáng)之功效,藥理學(xué)研究證明柴胡具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫增強(qiáng)、保肝利膽、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等作用,是常用中藥之一。柴胡中含有柴胡皂苷、揮發(fā)油、柴胡多糖、黃酮等多種有效成分,柴胡有效成分的提取分離多樣化,如溶劑提取法、超臨界流體萃取法(SFE)、高效液相色譜法(HPLC)、固相微萃取法(SPME)等,作者對(duì)柴胡有效成分提取分離方法的研究進(jìn)展做一綜述,以利進(jìn)一步的研究與開發(fā)利用。

1 柴胡皂苷的提取分離方法

柴胡皂苷為柴胡的主要有效成分,其結(jié)構(gòu)均為五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物,兼有親水性(糖鏈)和親脂性部分(苷元等)。主要的提取分離方法有溶劑提取法、超臨界CO2萃取法,大孔吸附樹脂法等。

1.1 溶劑提取

根據(jù)中藥中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì),選用對(duì)有效成分溶解度大,對(duì)不需要溶出成分溶解度小的溶劑,而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來(lái)的方法。常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流法及連續(xù)回流提取法等。翁麗麗等[2]以柴胡總皂甙為考察指標(biāo),通過水煎提取工藝的正交試驗(yàn)確定了柴胡最佳提取工藝條件:維持pH8-9,預(yù)先浸泡6 h,提取3 h,再進(jìn)行第2次提取2 h,其提取率可達(dá)0.883%。劉偉等[3]采用正交試驗(yàn),以柴胡皂苷a、d為指標(biāo),確定最佳提取方法為加5%氨水甲醇30 mL,回流1 h,且回流方法相對(duì)優(yōu)于超聲提取法。柴胡皂苷a、c、d均為熱不穩(wěn)定物質(zhì),提取分離時(shí)易發(fā)生化學(xué)變化[4],當(dāng)柴胡皂苷a、d降解后,生理活性大大降低,張相年等[5]采用60%的乙醇在低于55℃下提取柴胡粉末,濾液去溶劑后所得的漿狀液加入正丁醇,在低于55℃去除溶劑得皂苷粉末,結(jié)果柴胡總皂苷的收率為1.1%,富含皂苷a、c、d成分。

1.2 超臨界CO2萃取

超臨界流體萃取(SFE)技術(shù)是以超臨界流體(SCF)為溶劑,可應(yīng)用于多種液態(tài)或固態(tài)混合物中待分離組分的萃取。當(dāng)二氧化碳處于臨界狀態(tài)(溫度31.26℃,壓力7.36×103kPa)時(shí)即為超臨界流體。侯彩霞等[6]將傳統(tǒng)的水提醇沉法與CO2超臨界萃取法(SFE-CO2)進(jìn)行比較,得出SFE-CO2所得浸膏收率約為水提醇沉提取所得浸膏的6倍,浸膏中柴胡皂苷a含量約是水提醇沉工藝提取的2倍。這是由于傳統(tǒng)方法多數(shù)都有加熱過程或產(chǎn)熱過程,而SFE-CO2受熱小,并且同時(shí)具有液體溶劑的溶解能力和氣體的傳遞特性,萃取后溶質(zhì)和溶劑易于分離等優(yōu)點(diǎn),特別適合于熱敏性、易氧化物質(zhì)的分離或提純。而柴胡皂苷a和d受熱容易導(dǎo)致水解變性,這就是傳統(tǒng)提取分離方法的提取率較超臨界萃取法提取率的緣故。

1.3 大孔吸附樹脂

大孔吸附樹脂是一類不含離子交換基團(tuán)的交聯(lián)聚合物。通過其本身多孔性結(jié)構(gòu)而達(dá)到篩選效果。它的吸附性是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。由于吸附和分子篩的雙重作用,有機(jī)化合物可根據(jù)吸附力及相對(duì)分子質(zhì)量大小的不同,被吸附樹脂吸附后再經(jīng)一定溶劑洗脫而被分離[7]。具有吸附容量大、再生簡(jiǎn)單、效果可靠等優(yōu)點(diǎn),尤其適用于苷類、黃酮類、皂苷類、生物堿類等成分的提取分離及大規(guī)模生產(chǎn)。宋海妹等[8]用大孔吸附樹脂AB-8分離提取了柴胡皂苷b2,并得出大孔吸附樹脂層析法的最佳工藝:先用30%乙醇除雜,后用4倍柱體積70%的乙醇洗脫2個(gè)糖基或3個(gè)糖基的柴胡皂苷,柴胡總皂苷的提取率為1.96%。

1.4 硅膠柱層析

硅膠柱層析的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而實(shí)現(xiàn)分離,常用于單體組分的分離。劉繡華等[9]利用硅膠柱色譜法,經(jīng)溶劑萃取、硅膠柱層析及RP-8硅膠柱層析、IR、UV、DMS、1HNMR、等現(xiàn)代波譜分析過程,從三島柴胡的種子中分離出皂甙d、6′-乙酰皂甙d。Liu等[10]采用相同方法首次從北柴胡分離出皂苷v-1、6′-乙酰皂甙 b2。此外,反相硅膠樹脂在中藥有效成分提取分離上日漸增多。Tan等[11]使用反相凝膠柱色譜將15 g粗皂苷分離成21流分,第16流分經(jīng)RP-18色譜分離得到20 mg柴胡皂苷r。

1.5 高效液相色譜

高效液相色譜(HPLC)是60年代興起的新技術(shù),兼具分離和分析功能,具有分析速度快、效率高、靈敏度好、選擇性強(qiáng)、有效成分與雜質(zhì)較好地分離等優(yōu)點(diǎn),已逐漸成為中藥有效成分一種首選的分離分析方法。馬林等[12]利用HPLC法,以甲醇-水(66∶34)為流動(dòng)相,直接分離柴胡皂甙a、c、d。李媛媛等[13]采用HPLC-UV 法和中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件,建立了北柴胡的紋圖譜的測(cè)定方法,該指紋圖譜的提取、測(cè)試、分析方法對(duì)柴胡類藥材具有較好的分離效果和較廣泛的應(yīng)用范圍。

1.6 高效毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳(HPCE)是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,以毛細(xì)管為分離通道,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。它可實(shí)現(xiàn)很小體積帶電或不帶電組分的快速、高效分離。丁原菊等[14]以環(huán)糊精衍生物2-O-丙酮基-2-O-羥丙基-環(huán)糊精(2-AHP-β-CD)作為手性選擇劑,運(yùn)用毛細(xì)管電泳快速分離、測(cè)定柴胡中柴胡皂甙a,d對(duì)映體?？疾炝耸中赃x擇劑濃度、緩沖液濃度及其pH值對(duì)分離效果的影響,并確定了最佳電泳條件:緩沖液pH值8.0;2-AHP-β-CD濃度:5 mmol/L;硼砂濃度:40 mmol/L;分離電壓:20 Kv;電動(dòng)進(jìn)樣:20 KV/5 s;溫度:22℃;檢測(cè)波長(zhǎng):214 nm。在214 nm檢測(cè)波長(zhǎng)處,在硼砂緩沖溶液中,2-AHP-β-CD能使柴胡皂甙a,d異構(gòu)體在7 min內(nèi)得到分離和測(cè)定。2柴胡中揮發(fā)油的提取分離方法。

柴胡的揮發(fā)性成分含量較低,約占根的0.15%,有明顯的辛辣、芳香氣味。揮發(fā)油是解熱的主要有效部位之一[15],所以揮發(fā)油成分的提取分離也是比較活躍的研究領(lǐng)域。其提取主要有藥典法、水蒸氣蒸餾法[16]、蒸餾法和SFE-CO2[17]、SPME[18]。

葛發(fā)歡等[17]對(duì)SFE-CO2和水蒸氣蒸餾法提取柴胡揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行了比較,SFECO2法和水蒸氣蒸餾法得到的揮發(fā)油組成相同,提取率分別為1.86%和0.24%,提取時(shí)間分別為4 h和12 h,可見SFE-CO2法比水蒸氣蒸餾法提取率提高,提取時(shí)間縮短。李秀琴等[19]通過對(duì)多種提取工藝(藥典法、水蒸氣蒸餾法、蒸餾法)和SFE-CO2的比較,結(jié)果SFE-CO2的得油率為0.46%,約高出其他方法7倍,但不同的提取方法所得揮發(fā)油的化學(xué)成分及其含量差異較大。

SPME為一種非溶劑型選擇性萃取法,具有方法簡(jiǎn)便、無(wú)需試劑、提取效果好等優(yōu)點(diǎn)。曾棟等[18]采用固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)分離分析干柴胡藥材中26種揮發(fā)性成分,較傳統(tǒng)共水蒸餾提取法操作簡(jiǎn)單、快速、樣品量少,且避免了有些藥物揮發(fā)性成分在傳統(tǒng)提取法的高溫條件下的熱不穩(wěn)定性,使結(jié)果更能反映出藥材實(shí)際揮發(fā)性成分。

3 柴胡中其他成分的提取分離方法

柴胡有效成分的研究除上述柴胡皂苷、揮發(fā)油成分外,其他一些具有生物活性的成分也取得了一定的研究進(jìn)展。張亮等[20]采用煎煮法從南柴胡中提取分離出柴胡多糖,得率為1%,應(yīng)用高分辨毛細(xì)管氣相色譜確定多糖主要由L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖等單糖組成。

梁鴻等[21]用硅膠柱色譜法從北柴胡分離得8個(gè)黃酮類化合物:柴胡色原酮酸,蘆丁,槲皮素,異鼠李素,異鼠李素3-O-葡萄糖甙,葛根素,7,4′二羥基異黃酮 7-O-β-D-葡萄糖甙,色氨酸。

馬文兵等[22]采用正交試驗(yàn)考察了提取溫度、時(shí)間、乙醇濃度和料液比對(duì)總黃酮得率的影響,確定總黃酮最佳工藝:提取溫度80℃,70%乙醇,料液比1∶30,回流提取2 h,總黃酮得率可達(dá)到3.41%。

Li等[23]用凝膠柱色譜方法從北柴胡根分離得到碳三十醇、α-菠甾醇、柴胡色原酮A、富馬酸和琥珀酸等。Liang等[24]用同樣方法分離得水仙苷、腺苷、尿苷、α-菠甾醇葡萄糖苷和木糖醇。

王寧等[25]對(duì)北柴胡地上部分的水提物用硅膠吸附柱色譜和凝膠柱色譜的方法結(jié)合理化性質(zhì)分析和波譜學(xué)手段(UV、NMR),分離得到β-谷甾醇、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、山柰酚-3,7-二-O-α-L-鼠李糖苷、7-羥基-2,5-二甲基-色原酮。

4 小 結(jié)

目前,柴胡有效成分的提取分離存在提取率不高,分離純化困難,有效成分純度低等問題。SFE-CO2、大孔吸附樹脂、硅膠柱層析、HPCE、HPLC等新技術(shù)取得很大發(fā)展,具有廣泛的應(yīng)用前景,但多為實(shí)驗(yàn)室研究階段,實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)尚需一定時(shí)間。因此,柴胡有效成分的提取分離研究有待進(jìn)一步開展。

[1] 劉燦坤,李文濤.柴胡的本草研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,1999,10(1):40.

[2] 翁麗麗,王永生,柳 燕.柴胡總皂甙提取工藝的研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,18(4):48.

[3] 劉 偉,董誠(chéng)明,范 婷,等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選柴胡中柴胡皂苷提取工藝[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2008,28(16):1350.

[4] 張 玲,王京娥.加熱時(shí)間對(duì)柴胡皂苷a含量的影響[J].中成藥,1997,28(4):212.

[5] 張相年,趙樹進(jìn),劉演波,等.柴胡總皂苷分離工藝的研究[J].華西藥學(xué)雜志2002,17(5):350.

[6] 侯彩霞,李淑芬,樊麗華,等.柴胡皂苷的SC-CO2+乙醇-水溶液萃取工藝研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(9):2397.

[7] 張靜澤,顏 艷.吸附樹脂分離技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)中藥雜志,2004,29(7):628.

[8] 宋海妹,蘇小鳳,李 楠,等.柴胡皂苷的提取與鑒定[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,24(1):15.

[9] 劉繡華,汪漢卿.三島柴胡種子中的柴胡皂甙[J].化學(xué)研究,2000,11(1):8.

[10] Liu Q X,Liang H,Zhao Y Y,et al.Saikosaponin v-1 from roots of Bupleurum chinense DC.[J].J Asian Nat Prod Res.2001,3(2):139.

[11] Tan L i,Zhao Y Y,Zhang R Y,et al.A New Saikosaponin from Bupleurum scorzonerifolum[J].Chin J Pharm Sci,1996,5(3):128.

[12] 馬 林,何麗一,宋萬(wàn)志,等.柴胡皂甙的高效液相色譜分離與測(cè)定[J].藥物分析雜志,1994,14(2):6.

[13] 李媛媛,秦雪梅,王玉慶,等.北柴胡皂苷類成分的特征(指紋)圖譜研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(11):1500.

[14] 丁原菊,陸瑋潔,主沉浮,等.毛細(xì)管電泳法對(duì)柴胡中柴胡皂甙a與d對(duì)映體的分離和測(cè)定[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(工學(xué)版),2006,36(5):120.

[15] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].下冊(cè).上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1998:1358.

[16] 魏繼新,鄔科芳,史萬(wàn)忠,等.柴胡揮發(fā)油提取精制工藝研究[J].中成藥,2008,30(3):441.

[17] 葛發(fā)歡,李 瑩,謝健鳴,等.超臨界CO2從柴胡中萃取揮發(fā)油及其皂甙的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2000,25(3):149.

[18] 曾 棟,陳 波,姚守拙.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析干柴胡藥材中有機(jī)揮發(fā)物[J].分析化學(xué),2005,33(4):491.

[19] 李秀琴,孫秀燕,何仲貴,等.柴胡揮發(fā)油提取方法的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2004,39(2):103.

[20] 張 亮,胡海保,黃朝瑜,等.南柴胡多糖分離與組成的初步研究[J].中草藥,2000,31(9):647.

[21] 梁 鴻,趙玉英,崔艷君,等.北柴胡中黃酮類化合物的分離鑒定[J].北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,32(3):223.

[22] 馬文兵,曹端林,王建龍.北柴胡莖葉總黃酮提取工藝研究[J].中藥材,2010,33(2):288.

[23] Li Q C,Liang H,Zhao Y Y,et al.The Chemical Constituents from the Roots of Bupleurum Chinese[J].Chin J Pharm Sci,1997,6(3):165.

[24] Liang H,Bai Y J,Zhao Y Y,et al.The Chemical Constituents from the Roots of Bupleurum Chinese DC.[J].Chin J Pharm Sci,1998,7(2):98.

[25] 王 寧,王金輝,李 銑.北柴胡地上部分化學(xué)成分的分離與鑒定[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,22(5):342.