核酸適配體及其在病原微生物學(xué)中的應(yīng)用

梁紅茹，楊松濤，張濤，胡桂秋，夏咸柱

1 吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130062

早在1988年至1989年，按照生物化學(xué)性質(zhì)從人工合成的核苷酸庫(kù)中分離篩選核苷酸就已經(jīng)有廣泛的報(bào)道。1990年，Robertson等通過(guò)親和層析的方法從人為構(gòu)建的 RNA文庫(kù)中篩選到能夠高特異性和高親和力地結(jié)合小分子ATP的RNA序列，此段序列即為適配體[1]；同年，Tuerk等在試驗(yàn)室成功地從帶有8個(gè)隨機(jī)序列的RNA文庫(kù)中篩選出可特異性結(jié)合噬菌體T4 DNA聚合酶的序列[2]。

適配體 (Aptamer) 是一種經(jīng)體外篩選技術(shù)得到的寡核苷酸序列 (RNA或 DNA)，與相應(yīng)的配體有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力[3]，大小一般約6~40 kDa。單鏈寡核苷酸，特別是RNA的一些二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、莖環(huán)、假節(jié)、凸環(huán)、G-四聚體等，可使核酸分子形成多種三維結(jié)構(gòu)，成為適配體與靶物質(zhì)特定區(qū)域結(jié)合的基礎(chǔ)，二者之間的結(jié)合主要通過(guò)“假堿基對(duì)”的堆積作用、氫鍵作用、靜電作用和形狀匹配等產(chǎn)生高特異性的結(jié)合力。適配體具有高特異性、靶分子廣、易于體外合成和修飾等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在基礎(chǔ)研究、臨床診斷和治療中顯示了廣闊的應(yīng)用前景。本文主要對(duì)于適配體的基本特點(diǎn)及其在微生物學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 核酸適配體的特點(diǎn)

大量適配體的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過(guò)酶學(xué)或化學(xué)探測(cè)，原子核磁共振 (NMR) 和X衍射探測(cè)確定。由于它們的分子量相對(duì)比較小，NMR方法相對(duì)更加適合檢測(cè)適配體的結(jié)構(gòu)。

1.1 適配體的大小

大多數(shù)情況下，應(yīng)用的適配體應(yīng)盡可能的小，以使成本更低，可以更容易和靶標(biāo)結(jié)合等。因?yàn)楣δ躌NA折疊能力是有限的，適配體的最小長(zhǎng)度通常比可控的空間序列大，而且，從體外篩選過(guò)程最初得到的適配體約50個(gè)堿基，包括用于擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄的兩側(cè)固定序列區(qū)和中間隨機(jī)序列。重組缺失分析、印記和體外合成法可以用于確定綁定于靶標(biāo)所需的最短核苷酸的大小。最小的適配體長(zhǎng)度范圍相當(dāng)廣泛，例如在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子內(nèi)最小的長(zhǎng)度在23~35個(gè)堿基；最小的黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤配體有32個(gè)堿基；鏈霉素配體有46個(gè)堿基；與血液絲氨酸蛋白酶 (蛋白C) 結(jié)合的最小部分配體可達(dá)99個(gè)堿基。適配體分子量的范圍在 7.5~32 kDa，一般標(biāo)準(zhǔn)大小是10 kDa，標(biāo)準(zhǔn)適配體的暴露面積一般為50~60 nm2。

1.2 適配體的靶標(biāo)物質(zhì)

大量的體外篩選已經(jīng)表明篩選出的適配體可以特異地結(jié)合任何靶標(biāo)，包括小的離子 (例如Zn2+)、核苷酸 (例如ATP)、肽、大的糖蛋白 (例如CD4)、病毒粒子、細(xì)胞、甚至組織[4]，結(jié)合的靶標(biāo)的大小可以為65 Da到150 kDa，理論上沒(méi)有上限。

適配體結(jié)合靶標(biāo)有一定的特點(diǎn)：1) 適配體綁定蛋白質(zhì)的位點(diǎn)有一定的偏嗜性，大量報(bào)道表明適配體結(jié)合于蛋白質(zhì)的多聚陰離子位點(diǎn)，例如核酸或者葡糖氨基聚糖類，包括凝血酶和其他凝血級(jí)聯(lián)中的蛋白酶、大量的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子、病毒調(diào)節(jié)蛋白等；2) 適配體即使為不同的結(jié)構(gòu)，它們?cè)诖蟮鞍咨系慕Y(jié)合位點(diǎn)有高度的相似性。例如，研究發(fā)現(xiàn) 6種針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的適配體都結(jié)合在相同的區(qū)域，它們與肝素和其他天然配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合并交聯(lián)與同一個(gè)半胱氨酸，4個(gè)結(jié)構(gòu)不同的適配體與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合在同一位置。例如用3種RNA庫(kù)，不同的篩選程序，不同的篩選方法針對(duì) HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶篩選的適配體，它們都具有假結(jié)結(jié)構(gòu)并且都綁定于酶的相同位點(diǎn)[5]。

1.3 適配體的親和力

已報(bào)道的適配體和靶標(biāo)的親和力變化范圍很大，一般和小分子的親和力相對(duì)比較低，例如適配體與氨基酸結(jié)合，如瓜氨酸和精氨酸，親和力范圍在0.3~65 μmol之間；與ATP、黃嘌呤結(jié)合的親和力分別為6 μmol、3.3 μmol；與多巴胺結(jié)合的親和力是2.8 μmol；與維生素B12結(jié)合的親和力是9.0 nmol；適配體與典型核酸分子結(jié)合的親和力在納摩爾范圍，適配體與反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶結(jié)合的親和力為 10~800 nmol；與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合的親和力為0.3~20 nmol；與核蛋白結(jié)合的親和力約為2 nmol；與核糖體 RNA綁定氨基酸糖苷抗生素結(jié)合親和力大約是 0.8 nmol；免疫球蛋白家族所包括的蛋白質(zhì)篩選出的適配體親和力在2~40 nmol之間，這可能與免疫球蛋白和細(xì)胞表面糖蛋白的作用有關(guān)。

1.4 適配體的特異性

研究發(fā)現(xiàn)與靶標(biāo)有高親和力的適配體多數(shù)可以表現(xiàn)為高特異性，可以區(qū)別有相似酶活性的不同酶類，例如區(qū)分α-凝血酶和γ-凝血酶；區(qū)分貓免疫缺陷病毒和其他 3種反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄酶；區(qū)分僅僅有23個(gè)殘基不同的蛋白激酶C的同工酶；區(qū)分結(jié)構(gòu)僅僅是1個(gè)甲基的差別的咖啡因和茶堿。

然而，適配體也只是在一定程度上具有特異性，有時(shí)也可以非特異地識(shí)別非靶標(biāo)物質(zhì)。例如輔酶A的適配體也能夠識(shí)別 AMP；識(shí)別黃嘌呤的適配體可以識(shí)別鳥(niǎo)嘌呤，但是不能識(shí)別腺苷胞嘧啶或尿嘧啶。

2 核酸適配體的篩選方法

適配體的體外篩選過(guò)程稱為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Selective expansion of ligends by exponential enrichment，SELEX)，指模擬自然進(jìn)化人工篩選技術(shù)，首先體外化學(xué)合成一個(gè)隨機(jī)堿基數(shù)為n的單鏈寡核苷酸文庫(kù)，該文庫(kù)則含4n個(gè)不同的寡核苷酸序列，常用的寡核苷酸隨機(jī)序列含30個(gè)堿基，庫(kù)容量高達(dá) 430(1018)；隨機(jī)序列的兩端為隨后PCR循環(huán)時(shí)結(jié)合引物所必需的固定序列，由于這種隨機(jī)序列，而決定了庫(kù)中每條鏈自然形成的空間構(gòu)象，即二級(jí)結(jié)構(gòu)的多樣性，決定了庫(kù)中潛在地存在能與各種蛋白和低分子靶物質(zhì)有親和力的核酸配體[6]。一般篩選文庫(kù)的容量巨大 (可達(dá) 1015左右)，理論上應(yīng)用 SELEX技術(shù)能篩選到自然界幾乎所有靶分子的適配子[7]。

篩選過(guò)程包含和達(dá)爾文進(jìn)化理論一樣的 3個(gè)過(guò)程，分別是自發(fā)突變、自然選擇、大量增殖，一般包括幾輪篩選，每輪循環(huán)包括3個(gè)主要步驟：1) 寡核苷酸庫(kù)和靶標(biāo)分子孵育；2) 寡核苷酸復(fù)合物和未結(jié)合的寡核苷酸分離；3) 結(jié)合的序列用PCR擴(kuò)增[8]，再進(jìn)入下輪的篩選過(guò)程，通過(guò)重復(fù)的篩選與擴(kuò)增那些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的DNA或RNA分子被洗去，而與靶物質(zhì)有強(qiáng)親和力的DNA或RNA分子從非常大的隨機(jī)庫(kù)中分離出來(lái)且純度隨SELEX過(guò)程的進(jìn)行而增高，從pmol到nmol，有的甚至到μmol，最后占據(jù)庫(kù)的大多數(shù) (＞90%左右)[9]，隨著寡核苷酸庫(kù)的逐漸富集對(duì)靶標(biāo)的親和性增加。一般經(jīng)過(guò)6~15次的循環(huán)就可以獲得特異性的適配體。

3 核酸適配體在病毒方面的應(yīng)用

SELEX技術(shù)發(fā)展至今，已針對(duì)廣泛類型的病毒靶分子如逆轉(zhuǎn)錄酶、解螺旋酶、核衣殼蛋白和調(diào)節(jié)因子等篩選出了各自的適體。

目前 SELEX技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)的各項(xiàng)研究領(lǐng)域當(dāng)中，包括疾病的診斷和治療。在多種病毒病研究中顯示適配體能夠識(shí)別和結(jié)合到病毒的特定部位上，適配體可以作為功能阻斷劑直接影響病毒的復(fù)制、翻譯中特定步驟，從而中斷疾病發(fā)生；適配體也可以特異性的識(shí)別被病毒感染的細(xì)胞，從而用于診斷[10]。

3.1 在流感病毒方面的應(yīng)用

流感病毒表面血凝素蛋白 (HA) 呈柱狀，能與人、鳥(niǎo)、豚鼠等動(dòng)物紅細(xì)胞表面的受體相結(jié)合引起凝血，血凝素蛋白水解后分為輕鏈和重鏈兩部分，后者可以與宿主細(xì)胞膜上的唾液酸受體相結(jié)合，前者則可以協(xié)助病毒包膜與宿主細(xì)胞膜相互融合，血凝素是流感病毒最重要的抗原成分，也是抗體最重要的結(jié)合位點(diǎn)。

2004年，Jeon等篩選的 ssDNA適配體作用于HA的受體綁定區(qū)域，阻斷了病毒-宿主細(xì)胞的結(jié)合，而抑制流感病毒的感染，并且在細(xì)胞培養(yǎng)的試驗(yàn)證明篩選出的適配體可以阻斷病毒感染細(xì)胞[11]。2006年，Gopinath等針對(duì) A/Panama/2007/1999 (H3N2)株HA區(qū)域篩選出的適配體，和HA的親和性比單克隆抗體的親和性高約15倍，可以用于鑒定A型流感病毒的不同亞型，并且可以有效地抑制 HA介導(dǎo)的膜融合[12]。

3.2 在肝炎病毒方面的應(yīng)用

肝炎病毒是指引起病毒性肝炎的病原體。甲型肝炎病毒 (HAV) 呈球形，無(wú)包膜，核酸為單鏈RNA；乙型肝炎病毒 (HBV) 呈球形，具有雙層外殼結(jié)構(gòu)，外層相當(dāng)一般病毒的包膜，核酸為雙鏈DNA；丙型肝炎病毒 (HCV) 是一種具有脂質(zhì)外殼的RNA病毒，直徑50~60 nm，其基因組為10 kb單鏈RNA分子。

2001年，Butz等針對(duì)HBV核心抗原篩選的適配體在細(xì)胞內(nèi)和 HBV核心蛋白結(jié)合，能有效地干擾病毒衣殼的形成和病毒的生成[13]。2002年，Biroccio等篩選出針對(duì)HCV亞型1a的RNA適配體[14]；2003年，Bellecave等篩選出針對(duì)HCV亞型1b的DNA適配體[15]；2006年，Tomai等篩選出針對(duì)HCV亞型3a的DNA適配體，主要作用位點(diǎn)是RNA依賴的RNA聚合酶，抑制聚合酶的活性，從而干擾病毒的復(fù)制[16]。2009年，Kikuchi等篩選出針對(duì)HCV的IRES區(qū)域Ⅱ的適配體，IRES對(duì)于mRNA的轉(zhuǎn)錄很重要，因此適配體通過(guò)影響病毒的轉(zhuǎn)錄，從而影響病毒的復(fù)制[17]。2006年，F(xiàn)ukuda等篩選出針對(duì)HCV NS3的適配體，NS3為一種多功能酶，對(duì)于HCV的復(fù)制和病毒擴(kuò)增非常重要，篩選出的適配體在細(xì)胞水平上顯示能抑制病毒的繁殖[18]。

3.3 在艾滋病毒方面的應(yīng)用

艾滋病，又稱獲得性免疫缺陷綜合癥 (Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒 (Human immunodeficieney virus，HIV) 引起的人體細(xì)胞免疫功能缺陷，導(dǎo)致一系列條件致病微生物感染和腫瘤發(fā)生的致命性綜合征。

研究發(fā)現(xiàn)，在艾滋病毒的反轉(zhuǎn)錄酶上與適配體結(jié)合的裂隙是酶與病毒模板及引物結(jié)合的部位。Pheroze等篩選針對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶的適配體可以形成類假結(jié)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞水平上在病毒反轉(zhuǎn)錄的早期可以有效地干擾HIV的復(fù)制，阻礙病毒基因的延伸，并且毒性很小，較少形成耐藥株。2000年Yamamoto等篩選的針對(duì)Tat蛋白的RNA適配體，可以明顯抑制 HIV的活性，在細(xì)胞水平上可以使HIV-1的復(fù)制減少70%[19]。

3.4 細(xì)胞-SELEX病毒方面的應(yīng)用

病毒感染時(shí)，在復(fù)制、組裝、釋放過(guò)程中，病毒蛋白會(huì)插入到細(xì)胞的表面從而修飾細(xì)胞表面成分，細(xì)胞這種表面的改變或者產(chǎn)生的標(biāo)志物使細(xì)胞產(chǎn)生特異性的抗原，因此針對(duì)這種特異性的抗原設(shè)計(jì)探針可以檢測(cè)病毒感染的細(xì)胞。而且，病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的標(biāo)志物在未知的情況下，也可以用SELEX技術(shù)篩選出適配體，而這種識(shí)別特異性靶標(biāo)的適配體一旦篩選出可以用于檢測(cè)病毒感染的細(xì)胞。2009年，Tang等利用細(xì)胞-SELEX技術(shù)，篩選出識(shí)別牛痘病毒感染的A549細(xì)胞的適配體，它不僅識(shí)別病毒感染細(xì)胞，而且識(shí)別細(xì)胞質(zhì)膜上病毒修飾成分[28]。

4 核酸適配體在細(xì)菌方面的應(yīng)用

4.1 在細(xì)菌檢測(cè)方面的應(yīng)用

適配體檢測(cè)抗原是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，將一個(gè)適配體末端交聯(lián)到固相載體上作為捕獲分子，去捕獲待測(cè)標(biāo)本中的靶物質(zhì)，另一個(gè)適配體的5′端標(biāo)有相應(yīng)的指示劑，如熒光素、生物素、放射性同位素或膠體金等標(biāo)記轉(zhuǎn)化為檢測(cè)分子，當(dāng)檢測(cè)分子與相應(yīng)的待測(cè)標(biāo)本結(jié)合后就會(huì)產(chǎn)生信號(hào)，以達(dá)到檢測(cè)的目的。

結(jié)核分枝桿菌的基因編碼的早期分泌蛋白ESAT-6，僅存于結(jié)核桿菌和少數(shù)幾種非結(jié)核桿菌中，而所有的分支桿菌卡介苗菌株和非致病性分支桿菌中均缺失該基因，因此ESAT-6作為區(qū)分MTB感染和卡介苗接種或環(huán)境分枝桿菌感染的特異性抗原，2007年，馬占忠等以 ESAT-6為靶蛋白，通過(guò)SELEX技術(shù)篩選獲得ESAT-6的適配體，為結(jié)核病診斷和治療試劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)[21]。2010年，蔡江麗等獲得結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白 64抗體的適配體并進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)方面的研究[22]。2004年，潘勤等針對(duì)preppilS蛋白運(yùn)用SELEX篩選特異親和傷感桿菌WB型纖毛的RNA適配子，并進(jìn)行了初步RNA適配子庫(kù)的親和力以及生物學(xué)作用的檢測(cè)，為進(jìn)一步研究傷寒桿菌的致病機(jī)制和預(yù)防、治療傷寒熱癥的新型藥物提供了基礎(chǔ)[23]。

現(xiàn)在研究認(rèn)為細(xì)菌是一個(gè)含有多種成分的復(fù)合物，以整個(gè)細(xì)菌作為靶分子進(jìn)行篩選就可以在未知細(xì)菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、功能的情況下篩選出與其特異性結(jié)合的一組適配體，與單個(gè)適配體相比，一組特異性的適配體必定能提高檢出的敏感性和特異性；更重要的是組合應(yīng)用能夠提高適配體的通用性。

4.2 在細(xì)菌治療方面的應(yīng)用

雖然SELEX技術(shù)的研究應(yīng)用依然在初級(jí)階段，但是適配子作為直接蛋白配體、抑制劑以及臨床疾病的治療藥物已展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景，SELEX技術(shù)出現(xiàn) 8年后就已經(jīng)有應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的產(chǎn)品。適配體可以直接結(jié)合于靶物質(zhì)表位，使病原不能和機(jī)體結(jié)合而使疾病得到控制。因此在理論上，適配體可以被用于治療任何由有害基因的表達(dá)而引起的疾病，例如細(xì)菌感染、病毒感染、炎性疾病等。

2008年，楊清武等為獲得內(nèi)毒素 (LPS) 的抑制性適配子運(yùn)用于臨床膿毒癥的防治，建立了從隨機(jī)單鏈 DNA (ssDNA) 文庫(kù)篩選寡核苷酸的適配子的 SELEX技術(shù)平臺(tái)，為后續(xù)的治療性研究提供了平臺(tái)[24]。

適配體折疊后形成的特定三維結(jié)構(gòu)能與生物靶標(biāo)如蛋白質(zhì)結(jié)合，因此適配體可以直接作為蛋白配體，占據(jù)了致病因子的靶物質(zhì)表位，從而控制疾病的發(fā)生。

5 其他

原生動(dòng)物錐蟲(chóng)cruzi是導(dǎo)致Chaga病的病原蟲(chóng)，這種疾病通常侵犯神經(jīng)系統(tǒng)和心臟，未經(jīng)治療的死亡率很高。針對(duì)錐蟲(chóng)成蟲(chóng)期的RNA適配子能夠使平均受侵害的細(xì)胞中的錐蟲(chóng)數(shù)目呈劑量依賴方式減少。1 μmol/L的適配子能夠抑制50%~70%的錐蟲(chóng)的入侵。

此外，適配體可以作為分子探針用于很多疾病的診斷，例如通過(guò)篩選出特異性的適配體，可以用于腫瘤的診斷。

6 展望

適配體自問(wèn)世以來(lái)取得了令人鼓舞的進(jìn)步，特別是一些SELEX衍生技術(shù)的發(fā)展，使核酸適配體作為診斷和治療藥物的想法逐漸變?yōu)槭聦?shí)，迄今已有適配體藥物進(jìn)入臨床前期或臨床期試驗(yàn)，并逐步成為一類新型藥物。Merck Serono的董事 Bernhard Kirschbaum認(rèn)為 Aptamers將在下一代的治療藥物中起著非常關(guān)鍵的作用。

2004年末，Pifzer和Eyetech公司共同研制的用于治療濕性老年黃斑變性的核酸適配子藥物“Macugen”(又名Pegaptanib) 在美國(guó)被批準(zhǔn)上市，適配子在治療方面的研究越來(lái)越深入。Aptamera公司研制的 AGRO100是一種新型的核酸適體藥物，臨床前試驗(yàn)表明 AGRO100可在癌細(xì)胞表面與Nucleolin結(jié)合，抑制癌細(xì)胞 DNA的復(fù)制并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并對(duì)多種癌細(xì)胞均有抑制作用，如肺癌、宮頸癌、惡性黑色素瘤及白血病等，該藥已于2003年第3季度進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)。

適配體作為一種新型的核酸藥物正迅速發(fā)展，但是也存在一些不足之處，例如適配體雖然能與靶分子高親合強(qiáng)特異性結(jié)合，但它難以穿透細(xì)胞膜與靶分子接近；適配體的半衰期大多較短。為了克服適配體難以接近和穿透靶組織的缺點(diǎn)，位點(diǎn)特異的傳遞系統(tǒng)成為藥物合成研究的熱點(diǎn)，而采用基因治療的方法，構(gòu)建重組病毒然后在體內(nèi)表達(dá)外源的RNA適體也成為一種新思路。相信隨著適配體研究的深入，以及適配體篩選制備技術(shù)水平的提高，以上問(wèn)題將逐步得到解決。而且由于適配體的高特異性、高親合力、可修飾性，它不但在疾病的治療診斷上有十分廣闊的前景，而且在人類基因組學(xué)、蛋白組學(xué)的研究中也將成為極為重要的研究工具之一。

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