多拷貝策略在小肽表達(dá)中的應(yīng)用

曹艷萍，單安山，馬清泉，尹佳佳

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030

多拷貝策略在小肽表達(dá)中的應(yīng)用

曹艷萍，單安山，馬清泉，尹佳佳

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030

基因工程技術(shù)已經(jīng)在大分子多肽表達(dá)上得到了廣泛的應(yīng)用。但是小分子多肽不穩(wěn)定且易降解，使其表達(dá)后很難檢測(cè)和純化。多拷貝策略是將目的基因或是含有目的基因的表達(dá)盒首尾串聯(lián)，而串聯(lián)構(gòu)建多拷貝表達(dá)載體是目前解決小分子多肽表達(dá)量少的有效方法。總結(jié)和比較非對(duì)稱粘性末端互補(bǔ)法、接頭連接法、同尾酶法和表達(dá)盒串聯(lián)法在多肽表達(dá)方面的應(yīng)用情況，為小分子多肽的體外表達(dá)提供方法和思路。

多拷貝，串聯(lián)，多肽表達(dá)，應(yīng)用

1 非對(duì)稱粘性末端互補(bǔ)構(gòu)建法的應(yīng)用

非對(duì)稱粘性末端互補(bǔ)構(gòu)建法是由限制性內(nèi)切酶(AvaⅠ、EcoT 14 I等) 切割目的基因兩端酶切位點(diǎn)產(chǎn)生的或人為設(shè)計(jì)的非對(duì)稱粘性末端相連形成的。載體和插入片段的摩爾比例以及連接時(shí)間不同，得到的多聚體的拷貝數(shù)也不同。此法具有連接效率高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，且構(gòu)建的多聚體基因片段一般小于100 bp[4]。

Lee等[5]采用非對(duì)稱粘性末端法構(gòu)建了cGnRH-II的 4拷貝重組表達(dá)載體，并在大腸桿菌TOP10F中進(jìn)行了表達(dá)。胡學(xué)軍等[6]以人工合成的胸腺素a1基因?yàn)槟Ｐ?，采用限制酶EcoT 14 I 識(shí)別序列CCAAGG為小肽兩末端序列，利用其酶切后產(chǎn)生非鏡像粘性末端，一次連接反應(yīng)就構(gòu)建出了一系列不同基因拷貝數(shù)的表達(dá)載體，并且在大腸桿菌BL21(DE3) 中都得到了高效表達(dá)。賈秀娟等[7]在對(duì)糖尿病合并癥有積極防治意義的C肽的兩端各設(shè)計(jì)了一個(gè)SfiⅠ(5'-GGCCNNNNNGGCC) 的酶切位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生非回文的粘性末端利于C肽基因片段的串聯(lián)，另外在C肽的兩端分別加上KpnⅠ、PstⅠ酶切位點(diǎn)，與經(jīng)KpnⅠ、PstⅠ酶切的載體PET-30a相連接，成功構(gòu)建了5拷貝的重組表達(dá)載體PET-30a-C5，經(jīng)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)表達(dá)后，融合蛋白占超聲上清總蛋白的40%~50%。除用特定的限制酶酶切產(chǎn)生非對(duì)稱粘性末端以外，也可以人工設(shè)計(jì)非對(duì)稱粘性末端。Tian等[8]根據(jù) LfcinB15-W4，10氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性設(shè)計(jì)合成其編碼基因，人工設(shè)計(jì)非對(duì)稱粘性末端5'-CCGA/5'-TCGG，在T4 DNA連接酶作用下首尾串聯(lián)成1~7拷貝和9拷貝的多聚體編碼序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同拷貝數(shù)的多聚體基因序列都得到了特異性誘導(dǎo)表達(dá)，且四聚體融合蛋白表達(dá)水平最高，表達(dá)量為10 mg/L。Tian等[9]利用粘性末端法分別構(gòu)建了1~6拷貝的LH串聯(lián)基因，并且發(fā)現(xiàn)2拷貝在大腸桿菌E. coli C43中得到了高效表達(dá)，表達(dá)量為11.3 mg/L。Jain等[10]設(shè)計(jì)了帶有非對(duì)稱粘性末端的引物 (5'-TGGAATTCGCCCTTACGCGAT ATCCGTTAA/5'-GCCCCGGGACAAAAATTAGGAT CCAATCGCTAGCTGTGACAAGAGGTCGTTGCC)，克隆了編碼人gp41基因的保守區(qū)序列，并且構(gòu)建了3和5拷貝的重組表達(dá)載體。Wang等[11]同樣采用粘性末端互補(bǔ)法構(gòu)建了2、4、6、8拷貝的CAME表達(dá)載體，并對(duì) 4拷貝的重組表達(dá)載體進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)量為86 mg/L。由此可見，粘性末端互補(bǔ)法也是構(gòu)建多拷貝過程中常用的方法和行之有效的方法之一，特別是適合于目的基因堿基數(shù)少的單體的多聚體的構(gòu)建，但是不同聚合度的多聚體的形成較隨機(jī)。

2 同尾酶法的應(yīng)用

同尾酶是指兩種不同的限制性內(nèi)切酶，它們可以識(shí)別不同的酶切位點(diǎn)而產(chǎn)生相同的粘性末端，例如 Bgl Ⅱ(5'-AGATCT) 和 BamHⅠ(5'-GGATCC)。利用這一性質(zhì)對(duì)重組載體進(jìn)行單酶切和雙酶切，產(chǎn)生的線性化重組載體和插入片段具有相同的粘性末端，有助于多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建，同尾酶法在構(gòu)建多聚體的精確度上具有優(yōu)勢(shì)。

王震等[12]利用同尾酶的方法構(gòu)建了產(chǎn)甘油假絲酵母甘油合成關(guān)鍵酶基因CgGPD1的不同拷貝數(shù)的表達(dá)載體，并且研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同的NaCl或葡萄糖質(zhì)量濃度下，胞漿3-磷酸甘油脫氫酶 (GPDH) 的活性隨著CgGPD1的拷貝數(shù)的增加而增加，但表達(dá)量沒有提高。馬精彩等[13]通過基因重組技術(shù)，將從pPIC9-Hirudin中擴(kuò)增出的α-facor-Hirudin插入到載體 pAO815中，并構(gòu)建了多拷貝水蛭素重組表達(dá)載體 pAO815-(α-Hirudin)3，轉(zhuǎn)化GS115后得到了高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)1 600 U/mL，且表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗凝血活性。汪小福等[14]采用同尾酶的方法構(gòu)建了不同拷貝數(shù)的刺肩蝽 (Thanatin) 串聯(lián)融合表達(dá)載體，目的在于增加抗菌肽的表達(dá)豐度和抗菌肽的穩(wěn)定性。胡金川[15]同樣采用該法通過多次酶切、連接分別構(gòu)建了1~8拷貝的肽抗生素hPAB-β，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3拷貝的表達(dá)量最高且較穩(wěn)定。扈進(jìn)冬等[16]利用同尾酶法成功構(gòu)建了天蠶素B基因 (Cecropin B) 的3拷貝表達(dá)載體，為Cecropin B的進(jìn)一步研究和開發(fā)打下了基礎(chǔ)。Rao等[17]利用同尾酶法構(gòu)建了hPAB-β的2~8拷貝的多聚體，其中3拷貝的表達(dá)量為680 mg/L，比單體表達(dá)量提高了10倍多。同尾酶法在構(gòu)建多拷貝時(shí)雖然反復(fù)酶切連接較繁瑣，但是其構(gòu)建的多聚體較精確，利于后期的篩選。另外，為了避免反復(fù)酶切連接，也可以先將帶有同尾酶酶切位點(diǎn)的目的單體進(jìn)行自連，利用雙酶切篩選構(gòu)建正確的多聚體再與載體相連，這樣就可以減少酶切和連接的次數(shù)。

3 接頭連接法的應(yīng)用

接頭連接法是以自帶粘性末端的接頭為媒介將目的基因連接在一起形成串聯(lián)的重復(fù)單元，從而達(dá)到構(gòu)建多拷貝表達(dá)載體的目的。該方法操作簡(jiǎn)單，連接效率較高。蔣燕明等[18]分別設(shè)計(jì)了 4段 DNA片段XH1、XH2、EX1、EX2，退火連接形成2個(gè)接頭XH和EX，分別連到載體pPIC9K信號(hào)肽處的酶切位點(diǎn)XhoⅠ與EcoRⅠ之間，成功構(gòu)建了多拷貝表達(dá)載體 pPEX9K。Tian[19]設(shè)計(jì)了帶有 BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的接頭，成功構(gòu)建了2~7及9拷貝的LfcinB15-W4，10重組表達(dá)載體。Jiang等[20]采用接頭法成功構(gòu)建了 4~8拷貝的 CSEnc重組表達(dá)載體。接頭連接法操作簡(jiǎn)單，通過控制連接時(shí)間和接頭的比例一次就能構(gòu)建不同拷貝數(shù)的多聚體。同非對(duì)稱粘性末端法一樣,該法也適用于分子量較小的單體。

4 表達(dá)盒串聯(lián)法的應(yīng)用

表達(dá)盒是指包括啟動(dòng)子、信號(hào)肽、外源基因和終止子在內(nèi)的完整的表達(dá)調(diào)控序列。多拷貝表達(dá)盒串聯(lián)法是將完整的表達(dá)盒串聯(lián)，是表達(dá)盒的多拷貝，而不是目的基因的多拷貝，適用于二硫鍵數(shù)目較多的或是大分子蛋白的多拷貝構(gòu)建，降低了二硫鍵復(fù)性和構(gòu)象折疊的難度，通過此法構(gòu)建的多拷貝重組表達(dá)載體表達(dá)時(shí)，各個(gè)單一表達(dá)盒同時(shí)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物是目的蛋白單體。

易俊波等[21]將腦鈉肽基因 (BNP) 連接到經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切的pCW111載體之后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒用EcoRⅤ和SspⅠ酶切得到含有完整BNP的表達(dá)盒，另用EcoRⅤ單酶切所提質(zhì)粒，再用ALP去磷酸化，并將BNP表達(dá)盒與之連接構(gòu)建2和3拷貝表達(dá)載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2拷貝的表達(dá)量高于 3拷貝的表達(dá)量，Mansur等[22]采用表達(dá)盒構(gòu)建法成功構(gòu)建了 4和 6拷貝的胰島素原(MPI) 重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌GS115中得到表達(dá)，最高表達(dá)量為259 mg/L。Lee等[23-25]同樣采用表達(dá)盒串聯(lián)法構(gòu)建了含有不同拷貝數(shù)的BuforinⅡ表達(dá)盒的重組表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果顯示12拷貝的表達(dá)量最高，約為250 mg/L。表達(dá)盒串聯(lián)法更適用于大分子蛋白的多拷貝構(gòu)建。井申榮等[26]在體外構(gòu)建了人的白細(xì)胞介素-10的重組表達(dá)載體pAO815-aIL-10，并用BglⅡ和BamHⅠ雙酶切獲得目的基因重組表達(dá)盒(AOX-aIL-10)，再連接到BamHⅠ酶切位點(diǎn)處，依次構(gòu)建多拷貝重組表達(dá)載體pAO815-(AOX-aIL-10)n，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4拷貝和8拷貝的重組表達(dá)載體在畢赤酵母中的表達(dá)量最高，為(8.25±1.65) mg/L。何成等[27]將表達(dá)盒 (5′AOXHBsAg-TT) 重復(fù)導(dǎo)入載體，成功構(gòu)建了乙肝表面抗原 (HBsAg) 的不同拷貝數(shù)的重組表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)HBsAg表達(dá)量與拷貝數(shù)呈顯著正相關(guān) (t=8.714, P＜0.05)。Dheepak等[28]采用同樣的方法表達(dá)了紅酵母的環(huán)氧化物水解酶。由此可見，增加目的基因的拷貝數(shù)在一定程度上可以明顯提高其表達(dá)量。

5 多拷貝表達(dá)策略的研究展望

基因工程技術(shù)在食品、藥品、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)等各個(gè)領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，而小分子多肽的表達(dá)也成為了近幾年生物技術(shù)工作者所研究的熱點(diǎn)問題，但是由于小分子多肽自身所存在的問題使其表達(dá)量較少，因此，構(gòu)建多拷貝表達(dá)載體來解決這一問題顯現(xiàn)出了廣闊的前景。研究發(fā)現(xiàn)采用多拷貝策略在一定程度上能提高小分子多肽的表達(dá)量[29]，Kim等[30]構(gòu)建了2、4、8、12、16和32拷貝的Histonin表達(dá)載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12拷貝的表達(dá)量最高，可達(dá)168 mg/L。因此，通過對(duì)表達(dá)載體上游順式作用元件進(jìn)行改造，構(gòu)建目的基因串聯(lián)表達(dá)方式為小分子多肽的高效表達(dá)提出了新的思路和方法。根據(jù)目的蛋白的大小和所含二硫鍵的數(shù)目選擇合適的多拷貝構(gòu)建方法，使目的蛋白的表達(dá)量有很大的提高，為目的基因異源表達(dá)的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。多拷貝表達(dá)策略雖然能在一定程度上提高目的蛋白的表達(dá)量，但也不是絕對(duì)的，即表達(dá)量和拷貝數(shù)不成正比，Zhong等[31]分別構(gòu)建了2、4、8拷貝的hBD2表達(dá)載體，并且在E. coli BL21中進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)2拷貝的表達(dá)量最高，為760 mg/L。其具體原因和機(jī)理有待于進(jìn)一步探討和研究。

以上 4種構(gòu)建多拷貝的方法并不是單獨(dú)存在的，它們之間有著一定的聯(lián)系。在利用表達(dá)盒方法構(gòu)建多拷貝時(shí)就可以在表達(dá)盒的兩端引入同尾酶，將表達(dá)盒首尾串聯(lián)起來后再直接連入表達(dá)載體，或者也可以通過接頭連入表達(dá)載體；另外，在采用接頭連接法構(gòu)建多拷貝時(shí)也可將同尾酶引入目的片段的兩端，連接構(gòu)建目的基因的多聚體后利用接頭將其連入表達(dá)載體；也可通過非對(duì)稱粘性末端法構(gòu)建目的基因的多聚體，再通過接頭將其連入載體。本課題組正采用同尾酶和接頭連接兩種方法構(gòu)建雞 β-防御素 6的多拷貝表達(dá)載體，有望得到高效表達(dá)。由此可見，根據(jù)蛋白的特性，選擇一種或結(jié)合兩種合適的構(gòu)建多拷貝方法對(duì)突破小肽表達(dá)量小的瓶頸有重大意義。

[1] Liao SQ, Zhou ST, Zeng JY. The progress on biological antimicrobial peptides. Gansu Med J, 2009, 28(1): 16?20.廖世奇, 周思彤, 曾家豫. 生物抗菌肽的研究進(jìn)展. 甘肅醫(yī)藥, 2009, 28(1): 16?20.

[2] Shang F, Guo WM, Taylor A, et al. Dose dependent effects of dominant-negative K6W-ubiquitin: construction of mini-genes that encode multiple copies to K6W-ubiquitin. FASEB J, 24: Ib91.

[3] Wang AP, Wang S, Shen MQ, et al. High level expression and purification of bioactive human α-defensin 5 mature peptide in Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 84(5): 877?884.

[4] Zhang J, Yang YL, Tian ZG, et al. The construction strategy for tandem polypeptide genes. China Biotechnol, 2009, 29(8): 107?112.張軍, 楊雅麟, 田子罡, 等. 多肽串聯(lián)基因構(gòu)建策略.中國(guó)生物工程雜志, 2009, 29(8): 107?112.

[5] Lee SJ, Lee JH, Jin HJ, et al. A novel technique for the effective production of short peptide analogs from concatameric short peptide multimers. Mol Cells, 2000, 10(2): 236?240.

[6] Hu XJ, Zhang ZC, Bao YM, et al. A series of pET-derived vectors for high-level expression of the gene of multiple copies smaller peptide in E. coli. Chin J Biochem Mol Biol, 2002, 18(3): 287?292.胡學(xué)軍, 張志超, 包永明, 等. 小肽多拷貝基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其高效表達(dá). 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2002, 18(3): 287?292.

[7] Jia XJ, Yang JK, Cai SB, et al. Construction and expression of multi-copied human C-peptide gene in Escherichia coli. J Capital Med Univ, 2007, 28(3): 287?291.賈秀娟, 楊金奎, 柴三葆, 等. 多拷貝人 C肽基因的構(gòu)建及其原核表達(dá)研究. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 28(3): 287?291.

[8] Tian ZG, Teng D, Yang YL, et al. Multimerization and fusion expression of bovine lactoferricin derivative LfcinB15-W4, 10 in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(1): 117?124.

[9] Tian ZG, Dong TT, Yang YL, et al. Expression of antimicrobial peptide LH multimers in Escherichia coli C43(DE3). Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 83(1): 143?149.

[10] Jain S, Patrick AJ, Rosenthal KL. Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen. Vaccine, 2010, 28(43): 7070?7080.

[11] Wang YQ, Cai JY. High-level expression of acidic partner-mediated antimicrobial peptide from tandem genes in Escherichia coli. Appl Biochem Biotechnol, 2007, 141(2/3): 203?213.

[12] Wang Z, Rao ZM, Zhuge B, et al. Construction of multicopies vectors of key enzymes gene GPD1 in glycerol synthesis of Candida glycerolgenesis and its expression in Escherichia coli. J Food Sci Biotechnol, 2008, 27(5): 50?56.王震, 饒志明, 諸葛斌, 等. 產(chǎn)甘油假絲酵母甘油合成關(guān)鍵酶基因 CgGPD1多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá). 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2008, 27(5): 50?56.

[13] Ma JC, Cao XN, Xiong WL, et al. Construction of a multi-copy secretory expression vector and hirudin expression in Pichia pastoris. Tianjin Med J, 2010, 38(2): 112?114.馬精彩, 曹曉娜, 熊蔚俐, 等. 多拷貝水蛭素基因在畢赤酵母中的分泌型表達(dá). 天津醫(yī)藥, 2010, 38(2): 112?114.

[14] Wang XF, Liu RH, Chen XY, et al. Construction of vectors for expression of cleavable tandem repeat Thanatin fusion protein in plants. Hereditas, 2007, 29(6): 758?764.汪小福, 劉仁虎, 陳笑蕓, 等. 可剪切多拷貝抗菌肽融合表達(dá)載體的構(gòu)建. 遺傳, 2007, 29(6): 758?764.

[15] Hu JC. Design, expression and purifieation of tandem multimers of peptide antibiotie hPAB-β[D]. Chongqing: Third Military Medical University, 2004.胡金川. 肽抗生素 hPAB-β多拷貝串聯(lián)體的設(shè)計(jì)、表達(dá)與純化[D]. 重慶: 第三軍醫(yī)大學(xué), 2004.

[16] Hu JD, Wu YZ, Zhang GZ, et al. The construction of repeats copy expression vector of cecropin B in Pichia pastoris. Shandong Sci, 2008, 21(5): 21?24.扈進(jìn)冬, 吳遠(yuǎn)征, 張廣志, 等. 天蠶抗菌肽 B基因在畢赤酵母中多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建. 山東科學(xué), 2008, 21(5): 21?24.

[17] Rao XC, Hu JC, Li S, et al. Design and expression of peptide antibiotic hPAB-β as tandem multimers in Escherichia coli. Peptides, 2005, 26(5): 721?729.

[18] Jiang YM, Yang ZH, Ran YL, et al. Construction of a new multi-copy Pichia expression vector. J Guangxi Med Univ, 2005, 22(4): 511?513.蔣燕明, 楊治華, 冉宇靚, 等. 一種新型多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 22(4): 511?513.

[19] Tian ZG. Multimerization and fusion expression of antimicrobial Peptide LfcinB15-W4, 10[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2006.田子罡. 抗菌肽 LfcinB15W4, 10多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建及融合表達(dá)[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2006.

[20] Jiang SW, Trujillo MA, Eberhardt NL. An efficient method for generation and subcloning of tandemly repeated DNA sequences with defined length, orientation and spacing. Nucleic Acids Res, 1996, 24(16): 3278?3279.

[21] Yi JB, Mai ZG, Lu HR, et al. Construction and expression of recombinant expression vector for multi-copy B-type natriuretic peptide gene. Chin J Biologicals, 2008, 21(12): 1062?1065.易俊波, 買制剛, 盧海蓉, 等. 多拷貝腦鈉肽基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá). 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2008, 21(12): 1062?1065.

[22] Mansur M, Cabello C, Hernández L, et al. Multiple gene copy number enhances insulin precursor secretion in the yeast Pichia pastoris. Biotechnol Lett, 2005, 27(5): 339?345.

[23] Lee JH, Kim MS, Cho JH, et al. Enhanced expression of tandem multimers of the antimicrobial peptide buforin II in Escherichia coli by the DEAD-box protein and trxB mutant. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 58(6): 790?796.

[24] Lee JH, Minn I, Park CB, et al. Acidic peptide-mediated expression of the antimicrobial peptide buforin II as tandem repeats in Escherichia coli. Prot Expr Purif, 1998, 12(1): 53?60.

[25] Lee JH, Kim JH, Hong SS, et al. Multimeric expression of the antimicrobial peptide buforin II in Escherichia coli by fusion to a cysteine-rich acidic peptide. J Microbiol Biotechnol, 1999, 9(3): 303?310.

[26] Jing SR, Zou QM, Hong Y, et al. Construction of multiple copy expression cassette for expression of human interleukin-10 in Pichia pastoris. Chin J Biologicals, 2007, 20(2): 81?86.井申榮, 鄒全明, 洪愉, 等. 白細(xì)胞介素-10基因多拷貝表達(dá)盒的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達(dá). 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2007, 20(2): 81?86.

[27] He C, Cai PP, Lou JR. Construction of recombinant plasmid with multi-copy expression cassette for high expression of HBsAg in Pichia pastoris. Chin J Biologicals, 2008, 21(3): 207?211.何成, 蔡蓓蓓, 樓覺人. 多拷貝重組 HBsAg 質(zhì)粒的構(gòu)建及在畢赤酵母中的高效表達(dá). 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2008, 21(3): 207?211.

[28] Dheepak M, Roth R, Lalloo R, et al. Multi-copy expression and fed-batch production of Rhodotorula araucariae epoxide hydrolase in Yarrowia lipolytica. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 79(2): 235?244.

[29] Goto Y, Carter D, Guderian J, et al. Upregulated expression of B-cell antigen family tandem repeat proteins by Leishmania amastigotes. Am Soc Microbiol, 2010, 78(5): 2138?2145.

[30] Kim JM, Jang SA, Yu BJ, et al. High-level expression of an antimicrobial peptide histonin as a natural form bymultimerization and furin-mediated cleavage. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(1): 123?130.

[31] Zhong ZX, Xu ZN, Peng L, et al. Tandem repeat mhBD2 gene enhance the soluble fusion expression of hBD2 in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 71(5): 661?667.

Application of multi-copies in expression of smaller peptides: a review

Yanping Cao, Anshan Shan, Qingquan Ma, and Jiajia Yin

Institute of Animal Nutrition, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

The technology of genetic engineering has been widely used to express macromolecules such as enzymes. However, it is difficult to detect and purify the micromolecules such as small peptides, because of their instability and degradability. Construction of multi-copy recombinant expression plasmid can be achieved by inserting multiple target genes or expression cassette containing target genes with the same orientation into expression vector. This is effective to increase the expression level of small peptides. In this article we described four methods in order to provide some optional methods and ideas for the expression of active small peptides.

multi-copies, in series, expression of polypeptides, application

近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，一些有生物活性的小分子多肽受到了高度的重視，國(guó)內(nèi)外針對(duì)小分子多肽的大量研究表明某些小肽在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)保健、生物制藥和臨床應(yīng)用等方面有著廣闊的前景。但是由于其分子量小，在細(xì)胞中的穩(wěn)定性不好，容易被宿主蛋白酶識(shí)別并降解為無活性的寡肽片段[1]，另外其表達(dá)量也少，在一定程度上制約了小分子多肽的工業(yè)化生產(chǎn)。目前，采用構(gòu)建多拷貝表達(dá)載體的策略可以有效提高小分子多肽的表達(dá)量和穩(wěn)定性。Shang等[2]分別構(gòu)建了2、4和8拷貝的K6W-泛素重組表達(dá)載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)量隨拷貝數(shù)的增加而增加。多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建方法主要有非對(duì)稱粘性末端互補(bǔ)法、接頭連接法、同尾酶法和表達(dá)盒串聯(lián)法4種，每一種的構(gòu)建方法和適用范圍各不相同，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適合的方法構(gòu)建多拷貝基因表達(dá)載體。除此之外，也可采用含有卡那霉素抗性基因的表達(dá)載體pPIC3.5K和pPIC9K，通過增加的抗遺傳霉素抗性，在體內(nèi)篩選多拷貝插入子。Wang等[3]采用該法使人α-防御素-5的成熟肽得到了高效表達(dá)。本文對(duì)多拷貝策略的應(yīng)用進(jìn)行了分析和歸納，旨在為人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和利用多拷貝策略提供參考。

October 23, 2010; Accepted: January 5, 2011

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31072046), Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (No. 20092325110009), Scientific Research Fund of Heilongjiang Provincial Education Department (No. 11551z003).

Anshan Shan. Tel: +86-451-55190685; E-mail: asshan@mail.neau.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31072046)，高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金 (No. 20092325110009)，黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 (No. 11551z003) 資助。