魚類干擾素反應(yīng)及分子調(diào)控

張義兵，桂建芳

中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072

魚類干擾素反應(yīng)及分子調(diào)控

張義兵，桂建芳

中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072

干擾素反應(yīng)在脊椎動(dòng)物抵抗病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。近年來，魚類干擾素抗病毒免疫反應(yīng)的研究取得了重要進(jìn)展，不僅克隆鑒定了一系列魚類干擾素系統(tǒng)基因，而且通過功能研究揭示了魚類具有類似于高等哺乳類的干擾素反應(yīng)。但是，魚類干擾素反應(yīng)及分子調(diào)控具有自身特點(diǎn)。以下綜述了最近這方面的研究結(jié)果。

魚類，干擾素反應(yīng)，干擾素刺激基因，信號(hào)通路，分子調(diào)控

1 哺乳類IFN抗病毒反應(yīng)分子機(jī)制簡(jiǎn)介

IFN是人類發(fā)現(xiàn)的第一種細(xì)胞因子，一般在病毒等微生物感染時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)。IFN反應(yīng)被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物抵抗病毒入侵的第一道防線。哺乳類 IFN根據(jù)結(jié)合的受體不同分為I型IFN、II型IFN和III型IFN三類。在人基因組中，I型IFN由包括15個(gè)有活性的IFNα成員和14個(gè)假基因，1個(gè)IFNβ基因，1個(gè)有活性的 IFNω基因和 5個(gè)假基因，以及 1個(gè)IFNκ基因組成。所有的I型IFN基因串聯(lián)在第9號(hào)染色體短臂。II型IFN只包括1個(gè)基因IFNγ，包含3個(gè)內(nèi)含子，位于第12號(hào)染色體的長(zhǎng)臂。III型IFN由 2個(gè)研究小組在 2003年同時(shí)鑒定，由 IFNλ1、IFNλ2和IFNλ3組成，位于第19號(hào)染色體[2]。其中I型IFN和III型IFN被認(rèn)為具有共同的進(jìn)化起源，抗病毒性質(zhì)相似，又被合稱為“病毒誘導(dǎo)的IFN”。

關(guān)于I型IFN的信號(hào)通路研究較多[3]。宿主細(xì)胞一旦受到病毒感染，就能通過至少兩類模式識(shí)別受體 (Pattern-recognition receptors，PPRs) 識(shí)別病毒核酸 DNA或病毒復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的 dsRNA (Doublestranded RNA)：一類位于內(nèi)吞體膜上的Toll樣受體(Toll-like receptor) 如 TLR3，另一類存在于細(xì)胞質(zhì)中 的受體 RLR (Retinoic acid inducible gene I(RIG-I)-like receptor)，主要包括 RIG-I和 MDA5 (Melanoma differentiation-associated gene 5)。這兩類受體分別啟動(dòng)不同的信號(hào)通路，但最后都需要磷酸化激活一個(gè)共同的轉(zhuǎn)錄因子 IRF3 (IFN regulatory factor 3)。激活后的IRF3從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核，結(jié)合到IFNβ基因啟動(dòng)子PRDI和PRDIII (Positive regulatory domain I and III ) 上啟動(dòng)IFNβ的轉(zhuǎn)錄。激活的IRF3還能直接結(jié)合在某些ISGs (IFN-stimulated gene) 如ISG56、ISG54基因啟動(dòng)子的ISRE上直接啟動(dòng)這些基因的表達(dá)。誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFNβ分泌到細(xì)胞外，結(jié)合到鄰近細(xì)胞的IFN受體IFNAR1和IFNAR2導(dǎo)致 Janus kinase家族的Tyk2磷酸化，同時(shí) Tyk2與 Janus kinase 家族的另外一個(gè)成員JAK1又通過相互磷酸化被進(jìn)一步激活。激活后的JAK1與Tyk2又反過來磷酸化 Stat1 (Signal transducer and activator of transcription 1) 和 Stat2蛋白，導(dǎo)致Stat1:Stat2異源二聚體的形成，然后脫離 IFN受體與IRF9形成ISGF3 (Interferon-stimulated gene factor 3) 復(fù)合體，從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核結(jié)合到 ISGs基因啟動(dòng)子的調(diào)控序列ISRE (IFN-stimulated response sequence) 上，最終啟動(dòng)ISGs轉(zhuǎn)錄，其中包括IRF7的表達(dá)。新合成的IRF7被激活后參與誘導(dǎo)各種IFNα基因的表達(dá)。產(chǎn)生的IFNα蛋白又通過上述的Jak-Stat通路誘導(dǎo) ISGs的表達(dá)，形成一個(gè)正反饋的放大過程。PDC細(xì)胞 (Plasmacytoid dendritic cells) 主要產(chǎn)生IFNα，其信號(hào)通路有其細(xì)胞特異性[4-5]。

因此，IFN本身沒有抗病毒作用，需要誘導(dǎo)一系列抗病毒蛋白的表達(dá)才能建立宿主細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)[6]。目前已經(jīng)證實(shí)的由抗病毒蛋白介導(dǎo)的干擾素反應(yīng)有：Mx (Myxovirus-resistant) 蛋白介導(dǎo)途徑，蛋白激酶 PKR (Double-stranded RNA-activated protein kinase) 介導(dǎo)途徑，2’,5’-寡聚核酸酶 (2’-5’-oligoadenylate synthetase) 介導(dǎo)途徑，以及由ADAR (Double-stranded RNA-specific adenosine deaminase)介導(dǎo)的RNA編輯 (RNA editing) 機(jī)制等等。此外，有報(bào)道表明ISG15、ISG56、Viperin (Virus inhibitory protein，endoplasmic reticulum-associated，interferoninducible) 等ISGs同樣能介導(dǎo)IFN誘導(dǎo)的抗病毒作用，但是其中機(jī)制還有待于闡明。如ISG15是一種類泛素蛋白，通過類似于泛素化的機(jī)制與靶分子共軛結(jié)合 (Conjugating)，稱之為 ISGylation。ISG15通過修飾靶分子使之免于降解 (如作用于 IRF3) 或促使活性的改變 (如增強(qiáng)EIF4E2與RNA的5′帽子結(jié)構(gòu)的結(jié)合，但是卻抑制PPM1B的酶活性從而增強(qiáng)NF-κB信號(hào))。但不管怎樣，在IFN受體剔除小鼠中，感染致死量的辛德比斯病毒 (Sindbis virus)，過量表達(dá)ISG15卻能提高小鼠存活率。ISG56早期發(fā)現(xiàn)能夠抑制病毒蛋白的翻譯起始，但是最近的研究卻發(fā)現(xiàn)負(fù)調(diào)控IFN信號(hào)。

2 魚類具有干擾素抗病毒反應(yīng)系統(tǒng)

1965年，在發(fā)現(xiàn)哺乳類IFN 8年后，Gravell和Malsberger首次在傳染性胰腺壞死病毒 (IPNV)誘導(dǎo)的魚類培養(yǎng)細(xì)胞FHM中檢測(cè)到魚類干擾素活性[7]。此后從人工病毒感染或如poly I:C等誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的多種魚類培養(yǎng)細(xì)胞和魚體血清中檢測(cè)到IFN活性。我國(guó)學(xué)者在研究草魚出血病病毒 GCRV感染草魚培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，也從培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)有抗病毒活性物質(zhì)產(chǎn)生[8-10]。我們實(shí)驗(yàn)室利用紫外線滅活的GCRV在多種鯉科魚類細(xì)胞中也獲得了相似的結(jié)果[11-12]。這些研究雖然都未能成功分離純化魚類IFN蛋白，但是都表明魚類具有類似于哺乳類 IFN的抗病毒反應(yīng)。

隨著分子生物學(xué)研究的深入，魚類IFN基因以及與 IFN反應(yīng)相關(guān)的一些重要基因如 Stat家族成員、IRF家族成員、包括Mx等在內(nèi)的抗病毒效應(yīng)基因相繼被鑒定，從分子水平證明魚類存在IFN系統(tǒng)[13-15]。2003年，病毒誘導(dǎo)的魚類IFN基因隨著模式動(dòng)物基因組破譯的浪潮終于在斑馬魚、大西洋鮭、河豚率先獲得鑒定[16-18]。此后，IFN 基因在斑點(diǎn)叉尾 、虹鱒、鯽、鯉等多種魚類中也獲得鑒定。與病毒誘導(dǎo)哺乳類 IFN基因相似，病毒感染和利用poly I:C等誘導(dǎo)劑能誘導(dǎo) IFN基因的表達(dá)并伴隨著細(xì)胞抗病毒狀態(tài)的建立；過量表達(dá)魚類IFN基因能誘導(dǎo)下游ISG基因的表達(dá)，同時(shí)抑制病毒的復(fù)制；原核表達(dá)的IFN純化蛋白也類同于轉(zhuǎn)染IFN基因相同的效果[19]。魚類IFN自身同樣沒有抗病毒作用，阻斷細(xì)胞Stat1通路能顯著抑制IFN抑制細(xì)胞中病毒的復(fù)制，其機(jī)制在于阻斷了IFN誘導(dǎo)抗病毒基因的表達(dá)[19]。作為抗病毒基因，IFN 誘導(dǎo)表達(dá)基因如PKR[20]和 Mx[21]不僅具有類似哺乳類同源基因的結(jié)構(gòu)，而且在細(xì)胞中過量表達(dá)能顯著抑制病毒感染。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)魚類PKR也通過磷酸化底物eIF2α阻斷蛋白翻譯，從而抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制[20]。

3 病毒誘導(dǎo)的魚類IFN基因及其受體

目前已鑒定出兩類魚類IFN基因：一類與哺乳類II型IFN同源[22]。與哺乳類只具有一個(gè)IFNγ拷貝不同的是，很多種魚的基因組中至少有2個(gè)以上拷貝[23]。另外一類與哺乳類病毒誘導(dǎo)的IFN基因同源 (以下討論的都是這類IFN)。同源性分析發(fā)現(xiàn)魚類病毒誘導(dǎo)的IFN氨基酸組成與哺乳類I型IFN的同源性高于與哺乳類III型IFN的同源性。魚類病毒誘導(dǎo)的IFN基因也具有多拷貝，系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)魚類IFN獨(dú)立于哺乳類和鳥類IFN而自成一個(gè)進(jìn)化分枝，表明雖然所有脊椎動(dòng)物IFN有共同的進(jìn)化起源，但不支持單個(gè)魚類IFN基因與高等動(dòng)物單個(gè)IFN基因間存在對(duì)應(yīng)的直向進(jìn)化關(guān)系 (Orthologous relationship)。有趣的是，不同于哺乳類IFNα/β基因不含有內(nèi)含子，鑒定的魚類IFN基因都具有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，與哺乳類III型IFN的基因結(jié)構(gòu)相似 (有內(nèi)含子)[13,17]。由于魚類 IFN 基因具有與IL10家族基因相似的外顯子和內(nèi)含子的特點(diǎn)，因此有學(xué)者認(rèn)為，在進(jìn)化上魚類IFN基因可能代表一類古老的 IFN[17]。另外，已經(jīng)鑒定的斑馬魚4個(gè) IFN基因有3個(gè)串連在第3號(hào)染色體，而另外一個(gè)則位于第12號(hào)染色體[24]。相對(duì)于其他脊椎動(dòng)物，魚類發(fā)生過特有的第3次基因組加倍事件。4個(gè)斑馬魚IFN基因位于不同染色體是否源于這次特有的基因組加倍事件還有待證實(shí)。

根據(jù)魚類IFN氨基酸組成中所含的半胱氨酸數(shù)量的不同，可以將所有已知的魚類IFN分為兩類：group I IFN含有2個(gè)半胱氨酸，而group II IFN含有4個(gè)半胱氨酸[25]。系統(tǒng)進(jìn)化樹支持這個(gè)結(jié)論[19,24-27]。根據(jù)不同誘導(dǎo)劑在不同細(xì)胞中對(duì)大西洋鮭11種IFN基因的誘導(dǎo)表達(dá)特點(diǎn)以及對(duì)新發(fā)現(xiàn)的虹鱒IFN基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些IFN基因可以進(jìn)一步細(xì)分成4類[26-27]。group I IFN和group II IFN的功能似乎也有顯著差別[24]。在斑馬魚中，注射group I IFN蛋白在病毒和細(xì)菌感染時(shí)都能發(fā)揮作用，而 group II IFN 僅在病毒感染時(shí)有效[28-29]。比較抗病毒效應(yīng)基因的表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)序時(shí)發(fā)現(xiàn)，group II IFN誘導(dǎo)快速和瞬時(shí)的基因表達(dá)，而group I IFN誘導(dǎo)基因表達(dá)的特點(diǎn)是強(qiáng)烈和持久。因此group II IFN可能在病毒感染早期發(fā)揮作用[28]。體外研究也表明 group II IFN誘導(dǎo)Mx 的表達(dá)要弱于group I IFN[25]。

值得一提的是目前利用斑馬魚胚胎和幼魚所作的開創(chuàng)性工作使魚類IFN系統(tǒng)基因的功能研究上了一個(gè)新臺(tái)階。由于斑馬魚在發(fā)育早期 (前4~6周) 只有非特異性免疫發(fā)揮作用，因此斑馬魚胚胎和幼魚就成為了一個(gè)非常好的研究模型，而且可以利用Morpholino在胚胎發(fā)育時(shí)期進(jìn)行基因功能阻斷。運(yùn)用這個(gè)模型系統(tǒng)，法國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)斑馬魚的兩類 IFN通過結(jié)合不同的IFN受體發(fā)揮抗病毒功能。同哺乳類IFN一樣，魚類IFN受體由2個(gè)亞基組成。兩類魚類IFN共同使用一個(gè)短鏈?zhǔn)荏wCRFB5，但卻用不同的長(zhǎng)鏈?zhǔn)荏w：group I IFN為CRFB1，group II IFN為CRFB2[24,30]。很顯然，魚類病毒誘導(dǎo)的IFN受體與高等哺乳類I型和III型IFN受體相比是不保守的。

4 病毒誘導(dǎo)的魚類IFN反應(yīng)及IFN介導(dǎo)的Stat1通路

魚類IFN和受體不同于哺乳類的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)提出了一個(gè)基本問題：魚類IFN是否通過保守的Jak-Stat信號(hào)通路發(fā)揮作用？我們實(shí)驗(yàn)室在病毒感染的魚類培養(yǎng)細(xì)胞中鑒定了一系列的IFN系統(tǒng)基因，包括特異識(shí)別dsRNA的基因TLR3、RIG-I和MDA5，IFN基因，干擾素信號(hào)通路基因STAT1、JAK1，干擾素表達(dá)調(diào)控基因 IRF1、IRF2、IRF3、IRF7、IRF9，抗病毒基因 Mx1、Mx2、IFI56、PKR-like、PKR、Viperin、ISG15-1、ISG15-2、ISG15-3等等[14-15,19]。在哺乳類，這些基因在IFN信號(hào)通路中的不同結(jié)點(diǎn)上發(fā)揮作用。在病毒感染的魚類培養(yǎng)細(xì)胞中，這些基因受病毒誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)表明它們?cè)隰~類IFN抗病毒反應(yīng)中也可能發(fā)揮相似作用。利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，證實(shí)在培養(yǎng)細(xì)胞中過量表達(dá)鯽Stat1蛋白能促進(jìn)IFN的抗病毒作用，而轉(zhuǎn)染顯性失活突變載體(Dominant negative mutant) 阻斷Stat1的功能則削減IFN對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的保護(hù)能力。基因表達(dá)分析證明IFN發(fā)揮抗病毒作用需要經(jīng)過 Stat1通路誘導(dǎo)下游ISGs的表達(dá)[19]。事實(shí)上，IFN處理可以誘導(dǎo)大西洋鮭Stat1的磷酸化[31]；在Stat1基因缺失的人細(xì)胞株中過量表達(dá)斑馬魚Stat1基因，可以恢復(fù)正常的IFN信號(hào)，表明在IFN反應(yīng)中魚類Stat1功能的保守性[32]。但是，斑馬魚基因組有2個(gè)Stat1基因拷貝。這兩個(gè)拷貝的Stat1功能是否相同，或魚類基因組存在多個(gè)Stat1有何生物學(xué)意義仍不清楚[33]。

有關(guān)魚類 IFN反應(yīng)的啟動(dòng)研究最近也取得進(jìn)展。目前在哺乳類研究較多的 dsRNA受體如TLR3、RIG-I和Mda5也存在于魚類基因組中。雖然沒有證實(shí)魚類 RIG-I和下游分子 MAVS (The mitochondrial anti-viral signaling protein，也稱為IPS-1，VISA和CARDIF) 之間的相互作用，但是分別過量表達(dá)大西洋鮭RIG-I或MAVS能誘導(dǎo)細(xì)胞的IFN反應(yīng)，抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制[34]。魚類TLR系統(tǒng)有與哺乳類 TLR成員完全同源的基因，也具有自身特有的基因。如河豚基因組發(fā)現(xiàn)有TLR3同源基因，也有哺乳類不存在的TLR22。功能揭示河豚TLR3位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，TLR22位于細(xì)胞膜上，兩者都能識(shí)別病毒信號(hào)通過 Trif (TIR-domaincontaining adapter-inducing interferon-β) 途徑啟動(dòng)IFN 反應(yīng)，表明魚類具有不同于哺乳類的TLR-Trif-IRF3-IFN信號(hào)通路[35-36]。在另外一篇關(guān)于斑馬魚Trif的研究中發(fā)現(xiàn)，魚類Trif與哺乳類Trif是直向同源的進(jìn)化關(guān)系，但是序列出現(xiàn)了較大歧化。這些結(jié)構(gòu)上的差異可能是魚類 Trif不能與 Traf6 (Receptor associated factor 6) 結(jié)合行使類似哺乳類Trif功能的原因[37]。雖然如此，過量表達(dá) Trif仍然能夠啟動(dòng)IFN反應(yīng)，但是作者認(rèn)為由Trif啟動(dòng)的IFN反應(yīng)可能不經(jīng)過 IRF3/IRF7途徑[37]。我們實(shí)驗(yàn)室最近在研究鯽 IRF3的功能時(shí)也探索了該蛋白在dsRNA (poly I:C) 激活的IFN反應(yīng)中的作用，卻發(fā)現(xiàn)了不同于該研究的結(jié)果。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，阻斷IRF3幾乎能阻斷由胞外poly I:C啟動(dòng)的魚類IFN反應(yīng)，證明在TLR介導(dǎo)的魚類IFN反應(yīng)中，魚類IRF3具有類同于哺乳類IRF3的作用[38]。

5 魚類IRF3對(duì)IFN反應(yīng)的調(diào)控作用

如前所述，TLR和RLR途徑雖然啟動(dòng)不同的信號(hào)通路介導(dǎo)IFN反應(yīng)，但是最后都匯聚在一點(diǎn)，即都需要磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3[3]。哺乳類IRF家族共有 9個(gè)成員，鳥類還存在 IRF10。魚類基因組中存在所有發(fā)現(xiàn)的10個(gè)IRF成員，并且還有一個(gè)新成員IRF11，該基因與IRF1有非常近的親緣關(guān)系[32]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，魚類IRF1-IRF10與高等脊椎動(dòng)物的 IRF家族成員具有直向同源關(guān)系[33,38-39]。魚類IRF1是最早獲得鑒定的IRF家族成員，有報(bào)道表明過量表達(dá)IRF1能夠誘導(dǎo)IFN反應(yīng)[40]。哺乳類中IRF1同樣能夠調(diào)控IFN反應(yīng)，但是大量的研究表明，在這個(gè)過程中只有IRF3和IRF7發(fā)揮重要作用。

哺乳類IRF3是一個(gè)遍在表達(dá)蛋白，在正常細(xì)胞中沒有活性，其表達(dá)在病毒感染和IFN處理時(shí)不發(fā)生變化。大多數(shù)細(xì)胞不表達(dá)IRF7或表達(dá)很弱，僅在某些細(xì)胞如PDC (Plasmacytoid dendritic cells) 中有組成型表達(dá)。IRF7的表達(dá)受病毒和IFN誘導(dǎo)上調(diào)。這就是為什么在大多數(shù)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和 CDC (Conventional dendritic cells) 中，無論是經(jīng)TLR3途徑還是經(jīng) RLR途徑識(shí)別病毒信號(hào)都可以誘導(dǎo) IFNβ的產(chǎn)生，因?yàn)檫@些細(xì)胞都組成型表達(dá)IRF3。病毒感染激活的IRF3主要負(fù)責(zé)早期表達(dá)的IFNβ的表達(dá)；產(chǎn)生的 IFNβ可以誘導(dǎo)晚期表達(dá)的 IFN (大部分的IFNα) 的表達(dá)，在這個(gè)過程中IRF7發(fā)揮重要作用[3]。同時(shí)也可以理解為什么 PDC能高效表達(dá)IFNα而不是IFNβ[4]。PDC細(xì)胞啟動(dòng)IFN信號(hào)有其細(xì)胞特異性，利用TLR途徑 (TLR7/8/9而不是TLR3) 識(shí)別病毒核酸，其信號(hào)通路也不同于 TLR3介導(dǎo)的Trif-IRF3-IFN，而需要MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88) 和IRF7的相互作用[4]。因?yàn)镻DC細(xì)胞中表達(dá)的核酸受體為TLR7/8/9，且高表達(dá) IRF7，因此，該種細(xì)胞啟動(dòng) IFN信號(hào)的是TLR7/8/9途徑而不是RIG-I途徑[41]。事實(shí)上，過量表達(dá) IRF7不能誘導(dǎo) IFNβ基因啟動(dòng)子活性，而經(jīng)TLR7/8/9激活的IRF7和MyD88、TRAF6形成復(fù)合物在PDC細(xì)胞中介導(dǎo)IFNα的產(chǎn)生[4]。另外，早期表達(dá)的 IFNβ雖能誘導(dǎo)晚期 IFNα的表達(dá)，但不能誘導(dǎo)自身表達(dá)[42]；IFNα也不能誘導(dǎo)自身表達(dá)[43]。

我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，鯽IFN能通過Stat1途徑誘導(dǎo)自身基因的表達(dá)，因此在抗病毒免疫反應(yīng)中形成一個(gè)正反饋循環(huán)以在病毒感染初期放大 IFN反應(yīng)[19]。分析鯽IFN啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)2個(gè)典型的ISRE基序。突變分析證明這2個(gè)ISRE在鯽IFN基因的誘導(dǎo)表達(dá)中發(fā)揮重要作用，至少IRF3可能結(jié)合在該位點(diǎn)啟動(dòng)鯽IFN的表達(dá)[38]。因此，鯽IFN基因?qū)嶋H上也是一個(gè)典型的ISG。鯽IFN基因的自我表達(dá)調(diào)控性質(zhì)與哺乳類III型IFN相似，因?yàn)槿薎II型IFN不僅能被I型IFN誘導(dǎo)表達(dá)也能誘導(dǎo)自身表達(dá)[43-45]。在關(guān)于最初鑒定的3個(gè)斑馬魚IFN基因的研究中也有相同發(fā)現(xiàn)[46]。

魚類IRF3是否類似于哺乳類IRF3在調(diào)控IFN反應(yīng)中具有重要作用呢？最近的研究發(fā)現(xiàn)魚類IRF3的表達(dá)調(diào)控機(jī)制不同于哺乳類 IRF3：它們不僅受IFN誘導(dǎo)表達(dá)，而且還受各種IFN誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)表達(dá)。通過制備鯽IRF3的多克隆抗體，Western blotting證明魚類IRF3蛋白是一個(gè)IFN誘導(dǎo)的蛋白。分析鯽IRF3基因啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)含有ISRE基序。進(jìn)一步對(duì)已知的魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類IRF3基因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了有趣的結(jié)果：ISRE基序不僅存在于所有魚類 IRF3基因，而且在兩棲類IRF3基因的啟動(dòng)子中也存在。但是在爬行類、鳥類和哺乳類等羊膜動(dòng)物中不存在。在哺乳類，IRF3的組成型表達(dá)早有定論，因此可以斷定IRF3基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制在脊椎動(dòng)物的演化中發(fā)生了歧化，這種差異直接表現(xiàn)為基因調(diào)控序列的變異。功能研究證實(shí)脊椎動(dòng)物IRF3調(diào)控IFN反應(yīng)的功能應(yīng)該是一個(gè)古老的機(jī)制，因?yàn)樵隰~類培養(yǎng)細(xì)胞中過量表達(dá)IRF3可以誘導(dǎo)IFN及其下游ISG基因的表達(dá)，誘導(dǎo)ISG基因如Mx和Gig2表達(dá)需要細(xì)胞先產(chǎn)生IFN，這種調(diào)控結(jié)果與哺乳類類似[38]。

IRF3在調(diào)控IFN反應(yīng)時(shí)是否承擔(dān)了一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的角色？在哺乳類，病毒感染細(xì)胞激活細(xì)胞質(zhì)激酶TBK1 (TANK-binding kinase 1)，該激酶然后磷酸化激活I(lǐng)RF3蛋白，激活的IRF3蛋白從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核然后啟動(dòng) IFNβ基因的表達(dá)。因此，IRF3蛋白的磷酸化和入核可以當(dāng)作IRF3被激活的標(biāo)志。序列分析所有脊椎動(dòng)物IRF3蛋白的C末端具有一個(gè)保守的絲氨酸和蘇氨酸結(jié)構(gòu)域。將該結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸和蘇氨酸替換成天冬氨酸制備組成型激活鯽IRF3蛋白，在培養(yǎng)細(xì)胞中過量表達(dá)該突變體比野生型蛋白有更強(qiáng)的誘導(dǎo)IFN反應(yīng)的能力，證明磷酸化該結(jié)構(gòu)域在調(diào)控IFN反應(yīng)中的重要性。事實(shí)上我們也檢測(cè)到poly I:C等誘導(dǎo)劑能誘導(dǎo)IRF3的磷酸化。有趣的是，鯽IRF3在IFN處理的細(xì)胞中也能被磷酸化，而且在poly I:C和IFN處理的細(xì)胞中觀察到隨著誘導(dǎo)時(shí)間的推移，越來越多的IRF3蛋白從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核。因此，魚類IRF3能被IFN誘導(dǎo)激活，從而通過誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控IFN反應(yīng)[38]。

魚類 IRF3不同于哺乳類的表達(dá)調(diào)控和功能特點(diǎn)有什么生物學(xué)意義？在哺乳類，IRF3蛋白有較高水平的組成型表達(dá)、僅受病毒感染激活、被激活后的IRF3蛋白將在幾小時(shí)內(nèi)迅速被降解。這3個(gè)方面的特點(diǎn)保證當(dāng)細(xì)胞感染病毒時(shí)IFN反應(yīng)能在第一時(shí)間啟動(dòng)，但僅在病毒感染的細(xì)胞中發(fā)生，而且是適度發(fā)生。反觀在魚類中，IRF3有組成型表達(dá)，但是IFN能誘導(dǎo)IRF3表達(dá)和激活，表明當(dāng)病毒誘導(dǎo)IFN反應(yīng)后，誘導(dǎo)合成的IRF3蛋白能繼續(xù)被IFN激活參與IFN的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)。同時(shí)也表明，IRF3啟動(dòng)的IFN反應(yīng)不僅在病毒感染的細(xì)胞中啟動(dòng)，而且在IFN作用的細(xì)胞中，即使沒有感染病毒的情況下也能發(fā)生。因此，與哺乳類相比，魚類IRF3調(diào)控的IFN反應(yīng)是一個(gè)相對(duì)粗放的機(jī)制。鑒于兩棲類IRF3基因具有與魚類IRF3相同的表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)，在兩棲類中依賴 IRF3調(diào)控的 IFN反應(yīng)可能也具有類似魚類的特點(diǎn)。這些結(jié)果表明，隨著物種的演化，依賴IRF3調(diào)控的IFN反應(yīng)機(jī)制越來越趨于精確和完善[38]。

6 問題及展望

雖然魚類IFN系統(tǒng)基因的鑒定以及基因功能的研究最近取得重要進(jìn)展，但是關(guān)于基因功能的研究還不多，主要原因可能在于功能基因研究體系和技術(shù)平臺(tái)還沒能有效建立起來。我們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)IRF7能夠誘導(dǎo)魚類IFN的表達(dá)，但是與IRF3相比，作用較弱，是否與IRF3有協(xié)同作用還有待進(jìn)一步解析[38]。目前許多魚類IFN反應(yīng)研究還局限于基因鑒定和克隆，對(duì)基因功能的描述僅限于從蛋白同源性分析和表達(dá)特征比較上進(jìn)行推論。如IRF2、IRF9等雖然在魚類獲得克隆并且推斷在魚類的IFN反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，但目前還缺乏嚴(yán)謹(jǐn)證據(jù)。而較為系統(tǒng)的功能研究或許能發(fā)現(xiàn)魚類IFN反應(yīng)中特有的機(jī)制。TLR22和IRF3基因的功能研究從某種程度上就是一個(gè)例證。

目前，魚類IFN的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)引發(fā)了對(duì)其分類定位的討論。有學(xué)者依據(jù)魚類病毒誘導(dǎo)的IFN具有內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特征以及其受體與III型IFN受體更為同源的事實(shí)，把它們歸為III型IFN[17]。另有學(xué)者從蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)魚類IFN與哺乳類I型IFN更為相近，而且具有I型IFN保守的CAWE基序，認(rèn)為它們屬于古老的I型IFN[13,18,25,47]。高等動(dòng)物I型IFN的出現(xiàn)是因?yàn)檗D(zhuǎn)座事件取代了古老的I型IFN基因位點(diǎn)所致[25]。最近在兩棲類爪蟾基因組中發(fā)現(xiàn)了具有內(nèi)含子的I型IFN基因，為后一種觀點(diǎn)提供了更有利的證據(jù)[47]。在該研究中作者預(yù)測(cè)在魚類的基因組中可能存在目前仍沒被發(fā)現(xiàn)的具有內(nèi)含子的 III型IFN基因[47]。還有第3種觀點(diǎn)認(rèn)為，魚類IFN既然與高等動(dòng)物I型和III型IFN既有共同點(diǎn)又有不同點(diǎn)，因此不能以I型或III型來簡(jiǎn)單分類，建議命名為IFNφ[24,33]。

此外，許多保守的魚類 IFN系統(tǒng)基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了歧化，如報(bào)道的Trif基因和IRF3基因[31,37]，而蛋白結(jié)構(gòu)差異可能導(dǎo)致與哺乳類同源蛋白的功能差異。還有如魚類 PKR在一些種類有不同的拷貝數(shù)，N端dsRBM結(jié)構(gòu)域數(shù)目各異等等[48]?；蛘{(diào)控序列的變異也將導(dǎo)致功能的差異，如魚類IRF3的表達(dá)調(diào)控機(jī)制差異揭示了魚類IFN反應(yīng)的自身特點(diǎn)。

最后，魚類IFN系統(tǒng)還有自身特有的一些新基因，如魚類特有的PKZ基因[49-50]，僅發(fā)現(xiàn)在魚類和兩棲類基因組中存在的Gig2基因[51-52]，魚類特有的IRF11[33,47]等等。這些基因在魚類IFN反應(yīng)中的角色還有待研究。眾所周知，魚類經(jīng)過了一次特定的基因組加倍，隨著二倍化的進(jìn)程，許多基因在物種進(jìn)化過程中丟失，但是仍有一些基因具有多拷貝，如斑馬魚基因組中有2個(gè)Stat1基因[33]。這些多拷貝基因在功能上是互補(bǔ)還是冗余，以至于是否發(fā)生了歧化都需要在今后的研究中逐一證實(shí)。

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Fish interferon response and its molecular regulation: a review

Yibing Zhang, and Jianfang Gui

State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China

Interferon response is the first line of host defense against virus infection. Recent years have witnessed tremendous progress in understanding of fish innate response to virus infection, especially in fish interferon antiviral response. A line of fish genes involved in interferon antiviral response have been identified and functional studies further reveal that fish possess an IFN antiviral system similar to mammals. However, fish virus-induced interferon genes contain introns similar to mammalian type III interferon genes although they encode proteins similar to type I interferons, which makes it hard to understand the evolution of vertebrate interferon genes directly resulting in a debate on nomenclature of fish interferon genes. Actually, fish display some unique mechanisms underlying interferon antiviral response. This review documents the recent progress on fish interferon response and its molecular mechanism.

fish, interferon response, interferon-stimulated genes, signaling pathway, molecular mechanism

1957年，英國(guó)學(xué)者Alick Isaacs和Jean Lindenmann在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒的干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)感染病毒的細(xì)胞能分泌一種抗病毒蛋白[1]。這種抗病毒蛋白能誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞抗病毒狀態(tài)的產(chǎn)生、抑制多種同源和異源病毒的感染。他們把這種抗病毒蛋白命名為干擾素 (Interferon，IFN)，從此開始了脊椎動(dòng)物IFN系統(tǒng)半個(gè)多世紀(jì)的探索和發(fā)現(xiàn)。

December 17, 2010; Accepted: March 21, 2011

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2010CB126303), National Natural Science Foundation of China (No. 30871922), FEBL Research Grant (No. 2009FBZ01).

Yibing Zhang. Tel: +86-27-68780663; Fax: +86-27-68780123; E-mail: ybzhang@ihb.ac.cn

Jianfang Gui. Tel: +86-27-68780707; Fax: +86-27-68780123; E-mail: jfgui@ihb.ac.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2010CB126303)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30871922)，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(No. 2009FBZ01) 資助。