食用真菌喂養(yǎng)大鼠血漿抗氧化活性的測定

遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系(110101) 張中林 鄭劍玲 齊 賀

遼 寧 中 醫(yī) 藥 大 學(xué) 孫宏偉

超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)是兩種重要的生物氧化保護酶。SOD有銅-鋅-SOD、錳-SOD和鐵-SOD3種。它是清除和抗氧化最重要的金屬酶[1]。SOD能將組織細胞中的氧自由基通過歧化反應(yīng)生成過氧化氫和氧分子,從而減少氧自由基對細胞的損傷;GSH-Px是細胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化的酶活性保護系統(tǒng)中的重要成員之一,對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。近年來,一些學(xué)者開始合成或從天然植物中尋找具有清除氧自由基效能的有效成分,已取得很大的進展[2]。國內(nèi)已有關(guān)于真菌菌絲及子實體中 SOD檢測的報道[3-4]。本實驗以新鮮的食用真菌為材料,喂養(yǎng)大鼠觀察其血漿中 SOD和 GSH-Px活性改變。

1 材 料

1.1 動物和樣品 選取成年大鼠 36只,體重為 190～240g,由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,動物合格證號：SCXK(京)2004-0001,隨機分為 3組,分別為香菇真菌組、金針菇真菌組及對照組,每組各12只,雌雄各半,分圈飼養(yǎng),飲去離子水,自由進食。香菇真菌粉和金針菇真菌粉由遼寧省農(nóng)科院食用真菌研究所提供。實驗時分別稱取樣品各 5g,用純凈水配成 50m L的樣液,每只灌胃 4m L/100g體重給受試動物。每周稱重,給樣量根據(jù)每周體重增減調(diào)整,實驗時間為 40天。

1.2 藥物與試劑 鄰苯三酚：白色粉末,甌海化工試劑廠。無水乙醇：分析純,沈陽第一試劑廠。氯仿：分析純,天津化學(xué)試劑廠。50mmol/L Tris-HCL緩沖液pH 8.0。還原型谷胱甘肽(GSH)：上海化學(xué)試劑廠。 H2O2：天津市化工廠。5,5'-二巰基-2,2'-二硝基苯甲酸(DTNB)：黃色粉末,英國。

1.3 儀器 自動記錄分光光度計(日本 Shimadzu,UV-265)。離心機(北京醫(yī)用離心機廠,LD4-2A)。電熱恒溫三用水箱(北京永光明醫(yī)療儀器)。

2 方 法

2.1 制備血漿 稱體重,用 1%戊巴比妥進行腹腔麻醉(0.4m L/100g體重),開腹,腹主動脈采血,肝素抗凝,4℃冷藏。

2.2 血漿超氧化物歧化酶活性的測定

2.2.1 鄰苯三酚自氧化速率的測定 SOD活性(Marland法 )[5],取 3m L的 50mmol/L Tris-HCL,pH 8.0緩沖液做空白,用 UV-265島津自動記錄分光光度計,調(diào)零點,再取 3mL緩沖液加入鄰苯三酚,迅速混勻,然后快速倒入 1cm紫外比色杯中,25℃恒溫池中,波長為 325 nm,在 2分鐘內(nèi)連續(xù)測定其光密度值變化。計算線性范圍內(nèi)每分鐘光密度值的增加(△A),即為鄰苯三酚自氧化速率(△A0)。

2.2.2 樣品血漿 SOD活性的測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定酶活性。分別取 200μL血漿,加 200μL蒸餾水,振混 1分鐘后加 100μL冷無水乙醇,再振混 1分鐘,然后加 100μL氯仿,振混 1分鐘后,以3000 rpm/min,離心 10分鐘,上清備用。測試須先加入待測血漿于適量緩沖液中,混勻后,再加入鄰苯三酚,迅速混勻,然后快速倒入 1cm紫外比色杯中,25℃恒溫池中,波長為 325nm,在 2分鐘內(nèi)連續(xù)測定其光密度值變化。

2.2.3 樣品酶活性的計算 在溫度25℃,pH 8.0的條件下,檢測波長為 325nm,每 1m L反應(yīng)液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達 50%的酶量,定義為1個酶活力單位 U。

其原理：鄰苯三酚在堿性條件下,能迅速自氧化,釋放出 O2-,SOD能催化發(fā)生歧化反應(yīng),生成 H2O2和 O2,從而抑制鄰苯三酚的自氧化,反應(yīng)如下：2+2H→H2O2+O2樣品對鄰苯三酚自氧化速率的抑制率,即反映樣品中 SOD的含量。

2.3 GSH-Px酶活性測定 GSH-Px活性 (DTNB法[6],測定管取 GSH與上清液各 0.4mL,空白管以pH7.0磷酸緩沖液 0.4mL代替 GSH溶液。并以水代替真菌發(fā)酵液做非酶管。各管均置于 37℃預(yù)溫5分鐘,然后加入已預(yù)溫至 37℃的 H2O2溶液0.2m L,混勻并立即記錄反應(yīng)開始時間,繼續(xù)保溫 5分鐘,反應(yīng)完畢后,立即依次加入偏磷酸沉淀液4.0m L,使蛋白酶失活。以 3000 rpm/m in,離心 10分鐘,取出上清液 2m L,加入 Na2HPO4淀液 2mL,與DTNB試劑1.0mL混勻,迅速用 UV-265島津自動記錄分光光度計,412nm光波處測定光密度值。酶活力單位定義為：在溫度 37℃,規(guī)定 0.4mL上清液,每分鐘扣除非酶反應(yīng)的 Log[GSH]降低 1為一個酶活力單位(U)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件分析處理,計量資料以(±s)表示,組間比較用單因素方差分析,P＜0.05為差異有顯著性。

3 結(jié) 果

3組大鼠血漿中 SOD活性與 GSH-Px活性的改變(其中 7只大鼠自然死亡)。見表 1。

表1 不同食用真菌喂養(yǎng)大鼠血漿中SOD活性與GSH-Px活性的改變

香菇真菌喂養(yǎng)大鼠血漿中 SOD活性水平高于正常對照組,差異有顯著性(P＜0.05)。金針菇真菌喂養(yǎng)大鼠血漿中 SOD活性水平高于正常對照組,差異有顯著性(P＜0.05)。香菇真菌和金針菇真菌喂養(yǎng)大鼠血漿中 SOD活性差異無顯著性(P＞0.05)。

香菇真菌和金針菇真菌喂養(yǎng)大鼠血漿中 GSHPx酶活性與正常對照組,差異無顯著性(P＞0.05)。但 GSH-Px酶活性也有增加趨勢。

4 討 論

食用真菌類一般都是高等真菌的子實體,日常食用的有香菇真菌、金針菇真菌等多種。這些食用真菌不僅營養(yǎng)豐富,而且一直以其特有的食藥兼用性受到人們的青睞。國內(nèi)外學(xué)者對多種來源的SOD作了大量的研究,其開發(fā)應(yīng)用越來越受到重視[7]。GSH-Px在細胞抗氧化防御機制中的作用逐步受到人們關(guān)注[8]。

本次實驗用香菇真菌和金針菇真菌喂養(yǎng)大鼠,血漿中 SOD活性水平均高于正常對照組,差異有顯著性(P＜0.05)。香菇真菌和金針菇真菌喂養(yǎng)大鼠血漿中SOD活性水平差異無顯著性(P＞0.05)。香菇真菌、金針菇真菌喂養(yǎng)大鼠后,血漿中 SOD活性水平顯著提高,GSH-Px酶活性也有增加趨勢。目前可利用的 SOD資源主要為動物血液、細菌、高等植物以及微生物發(fā)酵產(chǎn)物。其中真菌以酵母菌為主,但酵母菌的去壁環(huán)節(jié)給工業(yè)化生產(chǎn) SOD帶來一定困難。食用真菌比細菌或其它工程菌發(fā)酵生產(chǎn)SOD更易通過毒理實驗,而且不必在所有產(chǎn)品中嚴格分離菌絲與發(fā)酵液。

SOD是重要的生物氧化保護酶之一。其活力的提高,有益于機體抗氧化能力的提高,它能使 O-2進一步生成 H2O2,而 GSH-Px則能使 H2O2迅速清除,兩者聯(lián)合作用可有效防止組織細胞受到氧化損傷[9]。SOD是人體抗氧化機制中的重要成分,尤其表現(xiàn)為對氧自由基的排除上。SOD通過其優(yōu)先被氧化,或修復(fù)氧化引起的損傷,從而對機體起到保護作用。實驗研究表明,氧自由基與人體衰老及多種疾病如冠心病、高血壓、老年癡呆、癌癥、白內(nèi)障等疾病有密切的聯(lián)系。抑制和清除氧自由基能延緩人體衰老和死亡,因此防御氧自由基對人體的健康損害有重要的現(xiàn)實意義。人們應(yīng)適量增加香菇和金針菇等食用真菌的攝入,因為食用真菌富含抗氧化營養(yǎng)素 SOD。目前,對 SOD資源的開發(fā)利用也是國內(nèi)外許多生物技術(shù)開發(fā)中心的重點藥劑開發(fā)項目。本次實驗為食用真菌中的 SOD、GSH-Px開發(fā)利用資源提供實驗依據(jù)。

[1] Mecord JMI,Fridovich.Superoxide dismutase an enzym ic function for erythrocuprein(hernocoprein)[J].J Biol Chem,1969,244：6049

[2] 劉鳳書,侯開衛(wèi),李紹家,等 .余甘子果汁超氧化物歧化酶的研究[J].熱帶作物學(xué)報,1992,13(2)：37

[3] 陸玲,潘欣,袁生.金針菇液體培養(yǎng)菌絲與子實體 SOD特性比較研究[J].中國食用菌,1999,18(5)：25

[4] 郭建春,王宇光,胡新文.幾種珍貴食用和藥用真菌超氧化物歧化酶 (SOD)的研究[J].熱帶作物學(xué)報,1995,增刊

[5] MARLAND S,MARKLUNDd G.Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogollol and a convenient assay for superoxide dismutase[J].Eur JBiochem,1974,47∶469

[6] HAFEMEN D G.Effect of dietary selenium on erythrocyte and liver glutathione peroxidase in the rats[J].JNutr,1974,104(5)∶580

[7] 方允中,李文杰 .自由基與酶[M].北京：科學(xué)出版社,1989：71

[8] 楊冬華,劉為紋.谷胱甘肽過氧化物酶與肝臟疾病[J].國外醫(yī)學(xué).消化系疾病分冊,1988,3(3)：139

[9] 崔旭 .D-半乳糖腦老化模型的脂質(zhì)過氧化機理[J].中國老年學(xué)雜志,1998,18(1)：38