HPLC法測(cè)定復(fù)方丹參片中丹參脂溶性成分的含量

張海江，胡靜雅，袁日琴

(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安223003)

0 引言

復(fù)方丹參片由中藥丹參、三七及冰片所組成，具有活血化瘀、調(diào)經(jīng)止痛、安神寧心的功效，臨床主要用于治療冠心病心絞痛及急性心肌梗死。丹參脂溶性成分被認(rèn)為是復(fù)方丹參片的活性成分之一，主要有隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA，并已有文獻(xiàn)對(duì)這些成分的HPLC含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究。中國(guó)藥典以丹參酮IIA作為丹參脂溶性成分的標(biāo)示化合物進(jìn)行復(fù)方丹參片的質(zhì)控，難以準(zhǔn)確反映復(fù)方丹參片的質(zhì)量?，F(xiàn)有的復(fù)方丹參片中丹參脂溶性成分含量測(cè)定方法的研究?jī)H針對(duì)其中的二至三種，同時(shí)測(cè)定以上所有四種成分的分析方法尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文首先采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析復(fù)方丹參片中的丹參脂溶性成分組成。在此基礎(chǔ)上，建立了HPLC含量測(cè)定方法，同時(shí)測(cè)定隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型 HPLC儀(G1311A四元泵，G1322A脫氣機(jī)，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315BDAD檢測(cè)器，Chemstation色譜工作站)，Bruker Esquire Ultra 6000電噴霧－離子阱質(zhì)譜儀。

1.2 試藥

丹參酮I、丹參酮IIA對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)生物藥品檢驗(yàn)所，二氫丹參酮、隱丹參酮對(duì)照品購(gòu)自成都康邦生物科技有限公司(HPLC方法分析，以面積歸一化法計(jì)算純度均大于98.5%)。甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Merck公司)，乙酸為分析純(江蘇漢邦科技有限公司)。復(fù)方丹參片(市售:北京某廠家，批號(hào):9122172;廣州某廠家，批號(hào):B9A023;河南某廠家，批號(hào):20090801;遼寧某廠家，批號(hào):090504;上海某廠家，批號(hào):100101。)

1.3 試液制備

對(duì)照品貯備液:取對(duì)照品二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA適量，精密稱(chēng)定，加入甲醇制成對(duì)照品混合液，即得。

供試品溶液的制備:取復(fù)方丹參片，除去糖衣，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇25 mL，放入50 mL容量瓶中，超聲處理15 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用尼龍膜濾過(guò)即得。

1.4 色譜/質(zhì)譜分析條件

色譜柱:Venusil－XBP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm，Agela公司)帶 C18 預(yù)柱(5 μm);流動(dòng)相A為冰乙酸:水=0.01:100(體積比)，流動(dòng)相B為冰乙酸:乙腈=0.01:100，提取方法優(yōu)化的線性洗脫梯度為:0～2min時(shí)0%B(體積分?jǐn)?shù))，20 min時(shí) 15%B，35 min時(shí) 45%B，35～45 min時(shí)45%B，60 min時(shí)75%B，60 ～80 min時(shí) 75%B，90 min時(shí)90%B;含量測(cè)定的線性洗脫梯度為:0～5min時(shí) 60%B，10～25 min時(shí) 70%B，30 min時(shí)90%B，流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為190～400 nm，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜分析條件:正離子檢測(cè)方式。分流后進(jìn)入質(zhì)譜儀，流量為0.25 mL/min，干燥氣體N2流量為10 L/min，干燥氣溫度為300℃，噴霧氣體N2壓力為25 psi，毛細(xì)管電壓為3500 v，掃描的質(zhì)荷比范圍為100～1500 m/z。HPLC/MSn的掃描寬度為0.9，CID 的 Fragment ampl.為 1.5。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 提取方法優(yōu)化

取廣州廠家的復(fù)方丹參片，除去糖衣，研細(xì)，稱(chēng)取約1 g，放入50 ml的容量瓶中，分別以純水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和純甲醇為提取溶劑，參照藥典方法，各加入25 ml，超聲處理15 min，放冷，以提取溶劑稀釋至刻度，過(guò)濾后按“1.3”項(xiàng)下提取方法優(yōu)化色譜條件進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果見(jiàn)圖 1。

圖中保留時(shí)間在60 min之前的為丹參水溶性成分，60min之后的為丹參脂溶性成分。結(jié)果表明，隨著提取溶劑中甲醇含量的增加，提取物中水溶性成分含量降低，脂溶性成分含量增大。因此，采用純水作為丹參水溶性成分的提取溶劑，采用甲醇作為丹參脂溶性成分的提取溶劑。

通過(guò)對(duì)溶劑倍數(shù)與超聲提取時(shí)間的優(yōu)化，得“1.3”項(xiàng)下的提取條件。

圖1 復(fù)方丹參片不同濃度甲醇提取液的HPLC圖

2.2 丹參脂溶性成分的定性分析

取廣州廠家復(fù)方丹參片，按“1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“1.4”項(xiàng)含量測(cè)定色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行HPLC/MS分析，進(jìn)樣量為20 μL，結(jié)果見(jiàn)圖2和表1。

通過(guò)與對(duì)照品的HPLC保留時(shí)間、UV圖譜及MS數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定主要成分為二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA。

圖2 復(fù)方丹參片中丹參脂溶性成分的HPLC圖譜(a)，MS－TIC圖譜(b)與標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜(c)

表1 復(fù)方丹參片中丹參脂溶性成分的HPLC/MS數(shù)據(jù)及鑒定結(jié)果

2.3 線性關(guān)系考察

逐級(jí)稀釋對(duì)照品儲(chǔ)備液1～100倍得到7個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，按“1.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣量為10 μL。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度(mg·mL－1)為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，計(jì)算回歸方程，見(jiàn)表2。

表2 各化合物的線性回歸方程

2.4 精密度試驗(yàn)

按“1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“1.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算精密度。二氫丹參酮 RSD 0.88%，隱丹參酮 RSD 0.42%，丹參酮I的RSD 0.26%，丹參酮IIA的RSD 0.28%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按“1.3”項(xiàng)下方法制備同一批供試品溶液3份，進(jìn)行HPLC分析(n=3)，計(jì)算每克復(fù)方丹參片中的各成分含量。二氫丹參酮含量 0.55 mg·g－1，RSD 1.86%;隱丹參酮含量 1.14 mg·g－1，RSD1.32%;丹參酮I含量2.70 mg·g－1，RSD 1.03%;丹參酮IIA含量1.86 mg·g－1，RSD 0.89%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)3 d內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定，每天連續(xù)進(jìn)樣3次，測(cè)定峰面積，計(jì)算二氫丹參酮RSD 1.42%，隱丹參酮 RSD 0.95%，丹參酮 I的RSD 0.93%，丹參酮IIA的RSD 0.77%，表明樣品溶液至少在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

配制二氫丹參酮 0.240 mg·mL－1、隱丹參酮0.448 mg·mL－1、丹參酮 I 1.080 mg·mL－1、丹參酮 IIA 0.778 mg·mL－1的對(duì)照品溶液 10 mL。分別精確量取0.8，1.0，1.2 mL 的對(duì)照品溶液各3 份于錐形瓶中，揮干，每份加入精密量取的廣州廠家復(fù)方丹參片粉末約0.4 g，混合均勻，精密加入10 mL甲醇，按“1.3”項(xiàng)下方法制得供試品。按“1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，計(jì)算平均加樣回收率。

2.8 樣品測(cè)定結(jié)果

各廠家藥片除去糖衣，研細(xì)，按“1.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液各3批，按“1.4”項(xiàng)色譜條件分析，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，分別計(jì)算各廠家1 g復(fù)方丹參片中二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量(mg·g－1)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 復(fù)方丹參片中的主要丹參脂溶性成分含量(mg·g－1)

3 結(jié)論

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)復(fù)方丹參片中的丹參脂溶性成分進(jìn)行了鑒定，在此基礎(chǔ)上建立了4種主要丹參酮成分的HPLC含量測(cè)定分析方法?？疾旖Y(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)單、快速。對(duì)市場(chǎng)上五個(gè)廠家的復(fù)方丹參片分析結(jié)果表明，各廠家的丹參酮成分組成較為相似，主要成分均為二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA，丹參酮ⅡA含量均符合藥典2005年版該品種每片含丹參酮ⅡA不得低于0.2 mg的規(guī)定。但各廠家的丹參成分含量差異較大。其中，丹參酮ⅡA的含量在1.01～1.90 mg·g－1，最大相差近一倍;丹參酮I含量最大相差4倍;二氫丹參酮和隱丹參酮含量最大相差達(dá)到10倍之多。因此，有必要提高復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，使市場(chǎng)上復(fù)方丹參片的質(zhì)量穩(wěn)定性得到更加有效的保障。

［1］朱大勝，付秀娟，譚生建.HPLC法同時(shí)測(cè)定丹參酮含片中四種成分的含量［J］.中國(guó)藥師，2008，11(4):301－303.

［2］譚生建，王文明，劉剛，等.HPLC法測(cè)定丹參酮滴耳液中二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(4):269－271.

［3］鄭曉珂，董三麗，馮衛(wèi)生.HPLC法測(cè)定丹參中丹參素、丹參酮ⅡA、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9(6):12－15.

［4］曹冬，黃喜茹，王偉，等.反相高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地和種屬丹參飲片中3種脂溶性成分［J］.化學(xué)試劑，2006，28(5):298 －300.

［5］黃喜茹，曹冬，詹文紅.RP－HPLC法測(cè)定復(fù)方丹參片中的隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮ⅡA［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2006，25(8):116 －118.

［6］楊敏，陳昕，王秋蓉，等.復(fù)方丹參片質(zhì)量評(píng)價(jià)方法研究［J］.世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2010(1):107－114.

［7］柳仁民，鄧愛(ài)霞，劉道杰.RP－HPLC測(cè)定復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA和隱丹參酮的含量［J］.中成藥，2005，27(3):267－269.