發(fā)酵產(chǎn)1，3-丙二醇的關(guān)鍵酶研究進(jìn)展

張宏蕊，金 平，劉樹臣

(1.遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧 撫順 113001；2.中國石化撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001)

1，3-丙二醇(1，3-Propanediol，1，3-PDO)是一種重要的化工原料，可直接用作防凍劑，也是增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料，廣泛用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)。1，3-丙二醇目前最主要的消費(fèi)領(lǐng)域是用作新型聚酯——聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的主要原料[1]。PTT具有良好的染色性、生物可降解性、抗污性，且具有和尼龍相當(dāng)?shù)捻g性、回彈性及抗紫外線性能，其研發(fā)生產(chǎn)引起了世界合成纖維行業(yè)的重視。我國是聚酯生產(chǎn)大國，但大宗工業(yè)用1，3-丙二醇仍需進(jìn)口，開發(fā)1，3-丙二醇是發(fā)展新型纖維的關(guān)鍵。因此，我國將1，3-丙二醇的生物發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)開發(fā)列為“十五”、“十一五”科技攻關(guān)項(xiàng)目[2]。

近年來，國內(nèi)外對產(chǎn)1，3-丙二醇的不同微生物進(jìn)行了詳盡研究，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、乳酸菌屬(Lactobacillusbrevis)、弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundii)、梭菌屬的丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)等，這些產(chǎn)1，3-丙二醇的天然菌株中含有的1，3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)都是以NAD為輔酶，其相關(guān)基因的克隆和表達(dá)已有較多報道[3～6]。發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的過程中，各代謝途徑中酶的作用舉足輕重。作者在此就近年來國內(nèi)外對發(fā)酵產(chǎn)1，3-丙二醇的關(guān)鍵酶的研究進(jìn)行了綜述。

1 1，3-丙二醇氧化還原酶

肺炎克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的過程是以甘油為底物，在甘油脫水酶(GDHt)的作用下轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物3-羥基丙醛；3-羥基丙醛在1，3-丙二醇氧化還原酶的催化下生成1，3-丙二醇。甘油脫水酶和1，3-丙二醇氧化還原酶是該代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其相關(guān)編碼基因dhaB及dhaT已在大腸桿菌(Escherichiacoli)中獲得成功表達(dá)，但dhaT的異源表達(dá)活性明顯低于dhaB[7]，容易導(dǎo)致中間產(chǎn)物3-羥基丙醛的積累，3-羥基丙醛會抑制1，3-丙二醇氧化還原酶和甘油脫水酶的活性，進(jìn)而影響菌體的生長和甘油的代謝[8]，在天然產(chǎn)1，3-丙二醇菌株Klebsiellapneumoniae體內(nèi)也存在類似問題。克雷伯氏菌屬兼性厭氧菌，并且其生理生化特性與大腸桿菌非常相近，這就為基因工程改良菌種和構(gòu)建基因工程菌奠定了生理基礎(chǔ)[9]。因此，美國DuPont公司構(gòu)建了產(chǎn)1，3-丙二醇的重組菌株，研究發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)入dhaT基因的重組Escherichiacoli也能產(chǎn)生一定量1，3-丙二醇。表明在Escherichiacoli中必定存在一種非異性的能催化3-羥基丙醛還原反應(yīng)的醇脫氫酶，在進(jìn)一步的研究中，將大腸桿菌自身的yqhD基因強(qiáng)化表達(dá)后，催化3-羥基丙醛的還原反應(yīng)得到顯著加強(qiáng)，1，3-丙二醇最終產(chǎn)量達(dá)到135 g·L-1[10]。這是由于yqhD基因編碼的1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶在微生物體內(nèi)可代替dhaT基因編碼的1，3-丙二醇氧化還原酶催化3-羥基丙醛生成1，3-丙二醇，并且催化活性遠(yuǎn)高于1，3-丙二醇氧化還原酶，同時該酶還能作用于多種含醛基團(tuán)的底物[11]。

朱建國等[12]以大腸桿菌(Escherichiacoli)基因組為模板，PCR擴(kuò)增出1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶基因yqhD，經(jīng)測序確認(rèn)，將yqhD基因與四環(huán)素抗性基因TetR同時插入表達(dá)載體pUC18構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18-yqhD-TetR，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)KlebsiellapneumoniaeME308；經(jīng)37℃、1.0 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)8 h，重組菌中1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶的酶活力達(dá)到4.16 U·mg-1，而對照菌株的酶活力僅為0.62 U·mg-1；將重組菌在搖瓶中進(jìn)行微氧發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，可將60 g·L-1甘油轉(zhuǎn)化為33.8 g·L-11，3-丙二醇。

在諸多產(chǎn)1，3-丙二醇的微生物中，肺炎克雷伯氏菌和梭菌屬的丁酸梭狀芽孢桿菌的產(chǎn)率較高。楊登峰等[13]以丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到1，3-丙二醇氧化還原酶基因dhaT。將它連接到pMD 18-T載體上，得到重組質(zhì)粒pMD-dhaT，對此重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，其DNA序列分析結(jié)果表明，dhaT基因全長為1158 bp。將dhaT基因插入表達(dá)載體pSE-380中，構(gòu)建成重組子pSE-dhaT，并在大腸桿菌JM109中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。研究表明，以1，3-丙二醇為底物時，基因工程菌經(jīng)37℃、1.0 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)14 h，酶活力達(dá)到16.28 U·mL-1，比原始菌株提高5～6倍。

2 甘油脫水酶

2.1 甘油脫水酶

生物法合成1，3-丙二醇通常都是以甘油作底物，經(jīng)甘油脫水酶(編碼基因dhaB)及1，3-丙二醇氧化還原酶(編碼基因dhaT)催化完成。甘油脫水酶在催化甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛的同時，會出現(xiàn)甘油導(dǎo)致的自殺性失活現(xiàn)象。失活的主要原因是甘油導(dǎo)致輔酶B12的C-Co鍵發(fā)生不可逆斷裂，形成5-脫氧腺苷和烷基鈷氨素類似物(即被修飾的輔酶)，同時烷基鈷氨素與脫水酶緊密結(jié)合，致使甘油脫水酶發(fā)生不可逆性失活[14]。因此，如何使失活的甘油脫水酶復(fù)活并提高其催化效率十分重要。

Toraya等將產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)中二醇脫水酶編碼基因與其兩側(cè)的兩段讀碼框編碼的基因在大腸桿菌(Escherichiacoli)中共同表達(dá)后，其感受態(tài)細(xì)胞能使失活的甘油脫水酶恢復(fù)其催化活性，也能激活甘油脫水酶-氰鈷氨素的復(fù)合體。因此，認(rèn)為這兩段讀碼框可能編碼二醇脫水酶復(fù)活蛋白(簡稱激活因子)，分別命名為ddrA和ddrB基因；后來的研究者發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了存在于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的甘油脫水酶激活因子和來源于弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundii)的激活因子。

來源于不同菌種的激活因子及其編碼基因略有差異，但交叉活化(Cross activatation)研究表明，來源于弗氏檸檬菌的激活因子dhaF-dhaG復(fù)合體，還可以有效地激活肺炎克雷伯氏菌中失活的甘油脫水酶及脫水酶—氰鈷氨素的復(fù)合體[15]。杜邦公司克隆出orfXor7并與甘油脫水酶編碼基因dhaB及1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶編碼基因yqhD串聯(lián)表達(dá)，所構(gòu)建重組菌的1，3-丙二醇產(chǎn)量明顯提高。張曉梅等[16]利用PCR技術(shù)擴(kuò)增來源于弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundii)的甘油脫水酶編碼基因dhaB以及甘油脫水酶激活因子編碼基因dhaG-dhaF，將其與1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶編碼基因yqhD串聯(lián)在溫控表達(dá)載體pHsh上，構(gòu)建重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)。SDS-PAGE分析顯示，融合表達(dá)產(chǎn)物的分子量同核酸序列測定的推導(dǎo)值相符。與未串聯(lián)甘油脫水酶激活因子編碼基因的重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)相比，1，3-丙二醇的產(chǎn)量提高了28%。

2.2 二醇脫水酶

Klebsiellaoxytoca的二醇脫水酶由3個亞基組成，形成一種六聚體結(jié)構(gòu)azB2，需要在輔酶B的輔助下才能有效地進(jìn)行催化，屬于第Ⅱ類以B12(Adenosylcobalamin，腺苷鈷氨素，AdoCb1)作輔酶的生物催化劑[17～19]。二醇脫水酶的作用主要是與輔酶B12有機(jī)結(jié)合后產(chǎn)生電子受體，從而將甘油或1，2-丙二醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛。二醇脫水酶很容易失活，底物甘油、氧以及輔酶類似物都是可能的誘導(dǎo)因素[20，21]。

Raynaud等研究發(fā)現(xiàn)，在以甘油為碳源、不含維生素B12的培養(yǎng)基上培養(yǎng)攜帶有ClostridiumbutyricumVPI 1718的1，3-丙二醇操縱子的E.coli時，能產(chǎn)生1，3-丙二醇并且檢測到很高的甘油脫水酶活性[3，22，23]，其結(jié)構(gòu)與K.oxytoca中依賴輔酶B12的二醇脫水酶沒有同源性。

鄭學(xué)瑞[24]從ClostridiumbutyricumDSM 10702基因組中擴(kuò)增到含甘油脫水酶(一種二醇脫水酶的同功酶，但不依賴于輔酶B12)基因的1，3-丙二醇操縱子，利用表達(dá)載體plTK將其轉(zhuǎn)入1，3-丙二醇生產(chǎn)菌K.oxytocaDA-1HB中，獲得了重組菌K.oxytocaPK，并研究了其生長代謝性能。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒穩(wěn)定性良好，厭氧搖瓶培養(yǎng)時的1，3-丙二醇產(chǎn)量提高了52.7%。

3 GDHt和PDOR的共表達(dá)

甘油脫水酶(GDHt)和1，3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)是甘油歧化為1，3-丙二醇的兩個關(guān)鍵酶。

曲薈錦等[25]采用多順反子重組和質(zhì)粒共存兩種策略，對來自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的兩個關(guān)鍵酶進(jìn)行共表達(dá)。構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT，將兩酶基因dhaB1B2B3和dhaT用SD序列相隔，在E.coliBL21(DE3)高水平共表達(dá)了GDHt 3個亞基和PDOR，表達(dá)蛋白分別約占菌體總蛋白的18%、9%、7%和9%。質(zhì)粒pET-28a-dhaB1B2B3和pET-22b-dhaT共轉(zhuǎn)化得到E.coliBL21(DE3)穩(wěn)定的雙質(zhì)粒系統(tǒng)，48 h后84%的細(xì)胞能同時含有兩種質(zhì)粒，GDHt 3個亞基和PDOR分別約占菌體總蛋白的16%、8%、6%和11%。

Zeng等[26]對Klebsiellapneumoniae的代謝工程改造進(jìn)行了大量研究，構(gòu)建了含有編碼甘油脫水酶和1，3-丙二醇氧化還原酶基因的質(zhì)粒，并將其插入野生菌種中，結(jié)果表明這兩個酶的活性得到了大幅提高。但是在實(shí)際的發(fā)酵過程中，該工程菌并未產(chǎn)出高濃度的1，3-丙二醇。這是因?yàn)樵贙lebsiellapneumoniae1，3-丙二醇合成途徑中，過于加強(qiáng)甘油脫水酶基因表達(dá)，導(dǎo)致NADH供應(yīng)不足而使3-羥基丙醛累積，對菌體生長及1，3-丙二醇合成造成負(fù)面影響。

研究發(fā)現(xiàn)，來自大腸桿菌的非特異性氧化還原酶是1，3-丙二醇氧化還原酶的同功酶(編碼基因yqhD，以NADPH為輔酶)，它在微生物體內(nèi)可代替1，3-丙二醇氧化還原酶(以NADH為輔酶)催化3-羥基丙醛生成1，3-丙二醇，是微生物轉(zhuǎn)化甘油生成1，3-丙二醇的另一重要用酶[27，28]。

諸葛斌等[29]為優(yōu)化Klebsiellapneumoniae1，3-丙二醇的合成途徑，利用PCR技術(shù)從大腸桿菌(Escherichiacoli)中擴(kuò)增出以NADPH為輔酶的1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶編碼基因yqhD，從克雷伯氏菌中擴(kuò)增出2.66 kb的甘油脫水酶基因(dhaB)，構(gòu)建了產(chǎn)1，3-丙二醇關(guān)鍵酶基因的串聯(lián)載體pEtac-dhaB-tac-yqhD，并將其轉(zhuǎn)入到野生肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)中，重組載體得到了表達(dá)。通過初步發(fā)酵，重組后克雷伯氏菌1，3-丙二醇的產(chǎn)量比原始菌提高20%左右，副產(chǎn)物乙酸和丁二醇產(chǎn)量分別下降30%左右。

4 展望

與化學(xué)合成法相比，微生物法產(chǎn)1，3-丙二醇具有選擇性好、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)物分離較簡單、無環(huán)境污染、可利用再生資源等優(yōu)點(diǎn)，符合當(dāng)今社會可持續(xù)發(fā)展和科學(xué)發(fā)展的要求。微生物法將逐漸取代化學(xué)法用于1，3-丙二醇的生產(chǎn)。

未來研究中，可從微生物中提取純化酶并將其商品化；可將酶固定化循環(huán)使用，節(jié)約成本；可制備模擬酶。模擬酶是根據(jù)酶的作用原理，模擬酶的活性中心和催化機(jī)制，用化學(xué)方法制成高效、高選擇性、比天然酶結(jié)構(gòu)簡單、具有催化活性且穩(wěn)定性較高的非蛋白質(zhì)分子的一類新型催化劑。最重要的是，在以后的研究中，必然還會發(fā)現(xiàn)與1，3-丙二醇氧化還原酶、甘油脫水酶等具有相同作用的酶，從而有更多菌種可以選擇，以便1，3-丙二醇的生產(chǎn)更普遍、更廣泛。

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