IGF-2和H19與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

楊季紅 程樹杰

近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，尤其是基因印跡在人類遺傳性疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用正引起越來(lái)越多研究者的注意［1，2］，這種表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象正在逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)?；蚪M印跡是一種導(dǎo)致父源性或者母源性等位基因表達(dá)的染色體修飾，由于其在新生命誕生時(shí)就已經(jīng)形成，所以這種修飾很可能是一種癌前事件，尤其是胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(IGF-2)/H19這組印跡基因，兩者的印跡缺失已經(jīng)被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的早期事件［3］。因此對(duì)基因印跡的研究可能為癌癥的早期診斷提供一些準(zhǔn)確的生物學(xué)指標(biāo)。

1 基因印跡

基因印跡(Gene Imprinting)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種不遵從孟德爾定律的、僅僅依靠單親傳遞某些遺傳學(xué)性狀的特殊現(xiàn)象，也就是某些基因呈親源依賴性的單等位基因表達(dá)，而其另一個(gè)等位基因不表達(dá)或者表達(dá)極弱，仿佛這些基因的不同親本來(lái)源的一對(duì)等位基因上帶有某種特殊的可供識(shí)別的印跡，故亦稱作基因組印跡(Genomic Imprinting)、配子印跡(GameticImprinting)或親源印跡(Parental Imprinting)。具有這種現(xiàn)象的基因稱為印跡基因(Imprinted Genes)?；蛴≯E的產(chǎn)生及其控制機(jī)制是十分復(fù)雜的，目前所知仍然有限;DNA差異性甲基化、特殊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等均可能在其產(chǎn)生及維持過(guò)程中占有比較重要的地位，其中最具重要的是DNA差異性甲基化?；蛴≯E的異?？赡芤韵率鋈N形式參與腫瘤的發(fā)生［2］:(1)印跡的抑癌基因的雜合性丟失(LOH)或單親二倍體(UPD)或突變失活可能會(huì)導(dǎo)致某個(gè)抑癌基因的惟一有功能的拷貝的丟失或不表達(dá);(2)印跡的癌基因的印跡丟失(LOI)或單親二倍體(UPD)則可能導(dǎo)致雙等位基因表達(dá)，表達(dá)量成倍增加;(3)印跡控制中心(DMR或ICR、指理論上可能會(huì)存在的某些對(duì)印跡現(xiàn)象有關(guān)鍵性影響的基因或順式元件)的突變性失活，可能會(huì)導(dǎo)致某個(gè)染色體印跡區(qū)域的多個(gè)印跡的癌基因的不正常表達(dá)。目前已知的與腫瘤相關(guān)的印跡基因至少有25種之多，如IGF-2、H19、p73、NOEY2 等。

2 DNA甲基化

自從Jones等［4］在1999年研究發(fā)現(xiàn)包括DNA甲基化在內(nèi)的共價(jià)修飾這一表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象同樣可以導(dǎo)致抑癌基因失活，致使癌腫發(fā)生，而且存在的范圍較基因突變更為廣泛以來(lái)，研究DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，可能存在于所有高等生物中，它是由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶催化，以s-腺苷蛋氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的一種反應(yīng)［5］。由于DNA局部甲基化增強(qiáng)在腫瘤中最為常見，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，已被認(rèn)為是腫瘤抑癌基因滅活的重要原因，使其成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一［6］。目前已報(bào)道的與腫瘤相關(guān)的甲基化基因較多，如細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控基因RASSFIA及ppENK等、錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH-1等、細(xì)胞黏附分子CD44等以及IGF2、H19、降鈣素等，這些基因的甲基化異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［7］。

3 H19基因的研究進(jìn)展

H19基因?qū)儆诎l(fā)育印跡基因，父源印跡、母源表達(dá)。H19基因定位于小鼠7號(hào)染色體的遠(yuǎn)端、定位人染色體11p15.5，系一單拷貝基因，人類H19基因全長(zhǎng)為3kb，共含有5個(gè)外顯子及4個(gè)內(nèi)含子。在第5外顯子上有RsaⅠ多態(tài)性酶切位點(diǎn)［8］。H19 mRNA有35個(gè)小的開放閱讀框(ORF)，最大的開放閱讀框是ORF6，其起始于第一個(gè)外顯子，終止于第二個(gè)外顯子，理論上可以潛在編碼一個(gè)含256個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)分子，但是在體內(nèi)以及各種細(xì)胞系中都檢測(cè)不到任何與這些開放閱讀框相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而且尚未發(fā)現(xiàn)H19基因與翻譯系統(tǒng)有聯(lián)系，因此大多學(xué)者認(rèn)為H19基因是目前發(fā)現(xiàn)的惟一不表達(dá)蛋白質(zhì)的印跡基因，而是在mRNA水平發(fā)揮其作用［9］，其在人和小鼠的胚胎期廣泛表達(dá)，參與胚胎的正常生長(zhǎng)、發(fā)育及小兒的行為發(fā)展。H19基因與以往發(fā)現(xiàn)的p53、Rb等基因一樣均為抑癌基因，是一種人類發(fā)育印跡基因［10］。在許多腫瘤細(xì)胞株研究中發(fā)現(xiàn)，H19基因的缺失和突變率均超過(guò)了p53基因的突變率。H19基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著非常重要的角色，是繼p53基因之后在腫瘤分子生物學(xué)上又一重大發(fā)現(xiàn)。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者就其與腫瘤的關(guān)系進(jìn)行了廣泛而深入的研究:Ayesh等［11］發(fā)現(xiàn)H19mRNA能使許多基因表達(dá)上調(diào)，而這些基因與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷徙和血管形成有密切的關(guān)系;Ariel等［12，13］早期研究發(fā)現(xiàn) H19轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為腫瘤胚胎 RNA，且和AFP一樣可作為肝癌的標(biāo)記物應(yīng)用于臨床;Tanos等［14］研究發(fā)現(xiàn)H19的過(guò)表達(dá)對(duì)食道癌及結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)很重要;王文玲等［15］研究發(fā)現(xiàn)H19在宮頸癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于宮頸上皮內(nèi)瘤變及正常宮頸組織，并且H19的表達(dá)與腫瘤的惡性程度及術(shù)后早期復(fù)發(fā)明顯相關(guān)，可作為判斷宮頸癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的檢測(cè)指標(biāo)。H19的印跡異常參與了許多遺傳病及腫瘤的發(fā)生，可能是一種抑制腫瘤浸潤(rùn)和進(jìn)展的基因，有可能成為判斷腫瘤浸潤(rùn)及進(jìn)展的標(biāo)志物。

3.1 與腎上腺皮質(zhì)腫瘤的關(guān)系 與其他許多腫瘤相比較，腎上腺皮質(zhì)腫瘤似乎減少了H19基因的表達(dá)，為了明確H19基因低表達(dá)的可能原因，高等研究了正常的腎上腺皮質(zhì)、增生的腎上腺皮質(zhì)、腎上腺皮質(zhì)腺瘤及腎上腺皮質(zhì)癌等組織H19基因的CpG島啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況。他們發(fā)現(xiàn)在腎上腺皮質(zhì)惡性腫瘤組織中，H19基因的CpG島啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平較其他組織明顯增加。因此，正常的H19基因的表達(dá)可以在正常及增生的腎上腺皮質(zhì)組織中檢測(cè)到，然而在腎上腺惡性腫瘤及腺瘤中，他們不僅驚奇地發(fā)現(xiàn)H19基因低表達(dá)、同時(shí)還發(fā)現(xiàn)IGF2基因高表達(dá)［16］。

3.2 與絨毛膜癌的關(guān)系 與腎上腺癌相比較，絨毛膜癌組織中H19基因表達(dá)上調(diào)、IGF2基因表達(dá)下調(diào)，這種改變的原因在于等位基因的充分甲基化［17］。從人類絨毛膜癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本中亦可以發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致H19基因表達(dá)上調(diào)的大量啟動(dòng)子甲基化的現(xiàn)象。這使得研究者Arima等［17］提出，在絨毛膜癌的情況下，H19基因的啟動(dòng)子突變，允許它克服了啟動(dòng)子CpG甲基化的轉(zhuǎn)錄抑制，從而導(dǎo)致H19的表達(dá)上調(diào)。

3.3 與肝癌的關(guān)系 在肝癌組織中，H19與IGF2表達(dá)的變化通常為單等位基因表達(dá)等位基因［18］。在體外實(shí)驗(yàn)中，在缺氧的條件下培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株其H19基因的表達(dá)上調(diào)。

3.4 與膀胱癌的關(guān)系 膀胱黏膜是胎兒時(shí)期H19基因RNA高表達(dá)的一種組織［19］。而在膀胱癌，H19基因表達(dá)上調(diào)存在于多數(shù)階段［20］。H19基因RNA的存在是一種膀胱癌向侵襲性癌及移行細(xì)胞癌快速發(fā)展的重要因素。在膀胱癌中，H19的印跡缺失位點(diǎn)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。

3.5 與乳腺癌的關(guān)系 除了青春期及孕期的乳腺組織以外，正常腺體組織是不表達(dá)H19RNA的。Adriaenssens等［21］研究發(fā)現(xiàn)72.5%的乳腺癌組織的H19基因顯示表達(dá)增加，在這些H19表達(dá)上調(diào)的乳腺癌組織中有92.9%的基質(zhì)細(xì)胞，2.9%的上皮細(xì)胞。Berteaux等［22］研究還發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中H19基因的過(guò)表達(dá)是促進(jìn)細(xì)胞增殖的原因。這些組織中H19的表達(dá)與腫瘤抑制蛋白P53及細(xì)胞增殖核抗原Ki-67相關(guān)［21］。然而，腫瘤抑制蛋白R(shí)b蛋白及轉(zhuǎn)錄抑制因子E2F6足以抑制H19在乳腺癌組織中的表達(dá)［22］。

4 參與的信號(hào)通路

在細(xì)胞內(nèi)H19RNA的確切作用目前尚不清楚，盡管目前已經(jīng)有許多已知的激活H19轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)及條件，并且已知H19對(duì)細(xì)胞周期活動(dòng)及狀態(tài)的影響，但是它是如何發(fā)揮這種作用的機(jī)制尚不明了。

4.1 上游效應(yīng)-激素調(diào)節(jié) Adriaenssens［23］在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，H19的高表達(dá)與類固醇受體的存在相關(guān)。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，雌激素的主要形式17-β-雌二醇和皮質(zhì)酮能夠單獨(dú)刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞H19的轉(zhuǎn)錄，而孕激素卻抑制這種效應(yīng)［23］。他莫昔芬是一種雌激素受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合劑并經(jīng)常用于治療乳腺癌的化療，17-β-雌二醇能單獨(dú)刺激MCF-7細(xì)胞的H19的轉(zhuǎn)錄，而增加他莫昔芬后則抑制了H19的轉(zhuǎn)錄，這就表明在H19的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中有一個(gè)假定的激素作用［23］。

4.2 下游的影響-血管生成，代謝，組織浸潤(rùn)和遷移 一項(xiàng)比較反義轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞H19的基因表達(dá)之間的差異的實(shí)驗(yàn)，提示以下的基因被上調(diào):uPar，c-src激酶，酪氨酸激酶2絲裂原活化蛋白激酶，酪氨酸激酶 2，c-jun，JNK1，Janus激酶 1，TNF-a，IL6，肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子，細(xì)胞間黏附分子1，NF-κB等［24］。這也表明，血管生成和FGF18可能是H19的轉(zhuǎn)錄RNA的潛在目標(biāo)［18］。由于功能及H19基因的RNA上調(diào)途徑參與的結(jié)果，目前認(rèn)為H19基因的RNA在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起著組織浸潤(rùn)，轉(zhuǎn)移和血管生成的關(guān)鍵角色［24］。

Lottin等［25］還發(fā)現(xiàn)，H19的表達(dá)呈正調(diào)控轉(zhuǎn)錄后硫氧還蛋白。至關(guān)重要的硫氧還蛋白是一種蛋白質(zhì)的減少氧化代謝過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)，其往往是高水平存在于過(guò)度表達(dá)H19基因的RNA的癌組織中。

5 IGF2基因

IGF2基因是第1個(gè)被證實(shí)的內(nèi)源性印跡基因，F(xiàn)einberg等［26］于1993年在人類中首次發(fā)現(xiàn)了IGF2等印跡基因，并且證實(shí)人類的IGF2基因是父系等位基因表達(dá)，母系等位基因印跡。IGF2位于人染色體11p15.5，全長(zhǎng)8.8 kb，共有 9個(gè)外顯子，8個(gè)內(nèi)含子，有P1～4個(gè)啟動(dòng)子。IGF2基因編碼的產(chǎn)物胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF2)，是一種重要的促胚胎細(xì)胞生長(zhǎng)因子，也是一種促有絲分裂肽，具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、胚胎形成、產(chǎn)后生長(zhǎng)發(fā)育等作用，生理?xiàng)l件下對(duì)胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，病理?xiàng)l件下能刺激腫瘤細(xì)胞的增殖。IGF2可通過(guò)自分泌或旁分泌的方式作用于細(xì)胞表面的IGF2受體。IGF2受體有Ⅰ型和Ⅱ型兩種，IGF2主要通過(guò)Ⅰ型受體介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮作用，Ⅱ型受體介導(dǎo)溶酶體內(nèi)吞噬溶酶體對(duì)IGF2的降解使其滅活［27］。目前IGF2被認(rèn)為是多種腫瘤重要的自分泌生長(zhǎng)因子，其過(guò)度表達(dá)已被證實(shí)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化的作用［28］。人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展與IGF2基因印跡調(diào)控異常有關(guān)。近幾年來(lái)的大量研究顯示，在肝癌［29］、胃癌［30］、結(jié)腸癌［31］等多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了IGF2印跡丟失的現(xiàn)象，提示IGF2的印跡丟失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切相關(guān)。

6 在腫瘤治療中的作用

在腫瘤細(xì)胞中H19RNA的功能尚不完全清楚，它在腫瘤細(xì)胞中存在多種類型表明，它可作為初步診斷，癌癥復(fù)發(fā)和惡性潛在的腫瘤標(biāo)志物而應(yīng)用于臨床［32－34］。

6.1 癌細(xì)胞中H19基因啟動(dòng)子的激活(以及在正常組織中的沉默)是導(dǎo)致基因療法中使用H19的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性基因表達(dá)的建議。目前利用基因H19啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)細(xì)胞毒性基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)正在小鼠身上開展［20］。

6.2 由H19基因與DT-A(白喉毒素)構(gòu)成的DTA-H19作為膀胱癌［35］、卵巢癌［36］和胰腺癌［37］的免疫治療方式已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。BC-819或DTA-H19這種質(zhì)粒真正體現(xiàn)了有針對(duì)性的治療方法，因?yàn)樗械馁|(zhì)粒進(jìn)入分裂的細(xì)胞，但是只在腫瘤細(xì)胞中才能發(fā)現(xiàn)由H19轉(zhuǎn)錄因子存在而導(dǎo)致的DT-A的表達(dá)，所以它僅僅破壞腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的功能。

在一項(xiàng)雙中心、以BC-819作為表淺性膀胱癌治療方案的Ⅰ期及Ⅱa期臨床實(shí)驗(yàn)中［38］，有超過(guò)70%的患者未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重副作用及腫瘤治療反應(yīng)，其中包括仍未采取優(yōu)化治療劑量及方案的患者。

BC-819曾作為表淺性膀胱癌、卵巢癌、轉(zhuǎn)移性肝癌的實(shí)驗(yàn)性治療，曾有一位面臨再次行膀胱全切除術(shù)的膀胱癌患者，在2004年應(yīng)用該項(xiàng)治療后未發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，且無(wú)不良反應(yīng)［38］;一位卵巢癌患者應(yīng)用該項(xiàng)治療后血中CA125的數(shù)值下降近50%，腹水中癌細(xì)胞亦大量減少;針對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌患者，應(yīng)用BC-819直接注射入腫瘤細(xì)胞，觀察到有相當(dāng)一部分腫瘤細(xì)胞壞死。

雖然在大多數(shù)癌癥類型的H19的表達(dá)譜眾所周知，H19RNA在影響癌細(xì)胞對(duì)藥物治療反應(yīng)的作用仍是未知數(shù)。然而，最近的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了當(dāng)H19 RNA大量存在時(shí)，硫氧還蛋白和p95(NCA-90)在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)［38，39］。這種理論可以導(dǎo)致更個(gè)性化的癌癥治療方案，例如，在H19過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中p95的表達(dá)可能表明對(duì)藥物毒性有較高的耐受性，因此對(duì)于H19的過(guò)表達(dá)(和p95)的個(gè)別癌癥患者，治療可能重點(diǎn)為放療或免疫治療，從而代替化療。

綜上所述，針對(duì)惡性腫瘤組織中IGF-2及H19印跡狀態(tài)及表達(dá)情況的研究，可能會(huì)對(duì)惡性腫瘤患者的早期診斷及預(yù)后提供一個(gè)新的思路。

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