番茄大花萼突變體MC基因的A FLP分子標(biāo)記及種質(zhì)資源篩選

李曉蕾，李景富，許向陽

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是茄科（Solanaceae）番茄屬（Lycopersicon）的一年生或多年生植物，原產(chǎn)于南美西部高原地帶。隨著市場的擴(kuò)展和消費者的增多，人們對番茄品質(zhì)的要求也越來越高。1994年美國Calgene公司開發(fā)了轉(zhuǎn)基因番茄“Flar Savr”，這是首次商業(yè)化應(yīng)用的改良轉(zhuǎn)基因食品，這種番茄能夠在貨架上擺放2周以上不變軟[1]。2002年，Vrebalov等發(fā)現(xiàn)番茄中的1個MADS-box基因與果實的成熟密切相關(guān)[2]。在百合中，轉(zhuǎn)LfMASD1反基因植株中1朵花的雄蕊極短、花藥缺失；轉(zhuǎn)LfMASD1正義基因植株中發(fā)現(xiàn)1個花萼變瓣的突變體。在轉(zhuǎn)LfMASD3反義基因植株中發(fā)現(xiàn)1個植株的苞葉部分瓣化，花柄變短[3]。含遲熟基因的品種外觀表現(xiàn)為大花萼，而含大花萼突變體MC基因的品種外觀表現(xiàn)也是大花萼。由此可見，花萼性狀與MC基因存在重要的相關(guān)性。同時，隨著生活水平的提高，人們對于番茄的外觀品質(zhì)要求日益提高，因此，通過研究MC基因培育外觀美觀的大花萼番茄品種也勢在必行。

目前，用于標(biāo)記基因的分子標(biāo)記主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified fragments length polymorphism，AFLP），由 Zabeau和Vos于1993年發(fā)明[4]，它實際上是RFLP和RAPD兩項技術(shù)的結(jié)合[5]。該技術(shù)同時具備了RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)高效性的特點，多態(tài)性強，試驗結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，典型的孟德爾遺傳方式。然而，它所顯示的只是擴(kuò)增片段的有與無，是顯性標(biāo)記。Wang等利用AFLP技術(shù)構(gòu)建了甜瓜(Cucumis melo L.)的遺傳連鎖圖，含有197個AFLP位點、6個RAPD位點與1個微衛(wèi)星位點，覆蓋了1 942 cM遺傳距離，并發(fā)現(xiàn)AFLP標(biāo)記在甜瓜圖譜構(gòu)建中比RAPD及SSR標(biāo)記更有效[6]。田雷等隨機選擇了30個AFLP的3+3引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，獲得清晰可見的DNA指紋圖譜[7]。張增翠等對不結(jié)球白菜優(yōu)質(zhì)品種矮抗6號及其父母本進(jìn)行了AFLP標(biāo)記分析，篩選出兩對AFLP引物組合，能清楚表明雜種一代與父母本之間的遺傳關(guān)系[8]。

本試驗主要研究了與番茄外觀品質(zhì)密切相關(guān)的花萼性狀，采用AFLP分子標(biāo)記方法在DNA水平上研究番茄大花萼基因，建立番茄AFLP分子標(biāo)記技術(shù)體系，構(gòu)建與番茄MC基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記。為分子標(biāo)記輔助選擇育種打下基礎(chǔ)，為培育番茄大花萼的品種提供理論和技術(shù)上的支持，并進(jìn)一步解決了市場對大花萼番茄品種的需求問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 番茄材料

大花萼突變體親本08085、正常親本08086以及08085和08086有性雜交的F2代單株。

材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組提供。

1.1.2 試驗試劑

CTAB、EDTA、RNase、TaqDNA聚合酶、MseⅠ、EcoRⅠ、T4DNA連接酶均為BMI公司產(chǎn)品，Repel、Binding為北京鼎國生物技術(shù)公司生產(chǎn)，尿素、甲酰胺、過硫酸銨、TEMED、甲叉均為Amsensco。DNA Marker、dNTP、AFLP引物由上海生工生物工程和大連生物公司合成或生產(chǎn)。其他試劑如氯仿、異戊醇、異丙醇、硫代硫酸鈉、無水乙醇、甲醛、冰乙酸、甲苯青、溴化乙錠等化學(xué)試劑由哈爾濱市寶瑞生物試劑公司和哈爾濱市德美試劑公司提供。Tris-HCl、瓊脂糖為進(jìn)口分裝，其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 田間調(diào)查

在番茄果實花期對父母本、F1及F2代群體的花萼大小進(jìn)行調(diào)查并記錄。為了保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，田間數(shù)據(jù)調(diào)查先后進(jìn)行3次。通過觀察后代的大花萼與正?；ㄝ鄦沃甑谋嚷?，用χ2測驗法計算是否符合3∶1的分離規(guī)律。

1.2.2 基因組DNA的提取及混合池的建立

番茄幼苗四葉一心時，取番茄植株幼嫩葉片，用自來水、蒸餾水沖洗兩遍，用濾紙吸干后稱取0.2 g于1.5 mL離心管，用液氮速凍后-20℃保存?zhèn)溆?；采用CTAB微量法提取DNA[9]。

從F2代群體選取9株大花萼單株和9株正?；ㄝ鄦沃?，將大花萼株系的DNA混合建立大花萼基因池，正?；ㄝ嘀晗礑NA混合建立正?；ㄝ嗷虺?。1.2.3 AFLP分子標(biāo)記

1.2.3.1 基因組DNA的酶切與連接

基因組DNA的Eco RⅠ、MseⅠ雙酶切和接頭的連接采用一步完成，其反應(yīng)體系如下：DNA 100～500 ng，Eco RⅠ（10 U·μL-1）0.5 μL，MseⅠ（10 U·μL-1）0.5 μL，Eco RⅠ adapter（5 pmol·μL-1）1.0 μL，MseⅠadapter（50 pmol·μL-1）1.0 μL，ATP（10 mmol·μL-1），10×buffer 5.0 μL，T4DNA 連接酶（5 U·μL-1）0.6 μL，加 ddH2O 調(diào)至 25 μL。37 ℃酶切與連接6～8 h或過夜（時間不能太長）。

1.2.3.2 DNA片段的預(yù)擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)增的體系：DNA（酶切連接后產(chǎn)物）2 μL，Eco RⅠ-primer（E00 50 ng·μL-1）0.6 μL，MseⅠ-primer（M00 50 ng·μL-1）0.6 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，MgCl21.2 μL，TaqDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，加 ddH2O 調(diào)至 20 μL。

預(yù)擴(kuò)增的程序：94℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃ 1 min，24個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止反應(yīng)。

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，預(yù)擴(kuò)增完成后，取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和1 μL Loading buffer混合后在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后在紫外燈下檢測預(yù)擴(kuò)增結(jié)果。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20～40倍，用于選擇性擴(kuò)增，余下的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物放在-20℃保存。

1.2.3.3 DNA片段的選擇性擴(kuò)增

選擇性擴(kuò)增的體系：DNA（預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30×）5 μL，Exx（50 ng·μL-1）1.0 μL，Mxx（50 ng·μL-1）1.0 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，MgCl21.2 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，加ddH2O調(diào)至20 μL。

選擇性擴(kuò)增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，65℃30 s(每個循環(huán)-0.7℃)，72℃ 1 min，12個循環(huán)；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min（每個循環(huán)+1 s），25個循環(huán)；72℃10 min；4℃終止反應(yīng)。

擴(kuò)增在PCR儀上進(jìn)行，選擇性擴(kuò)增完成后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入30%～40%的Loading buffer在PCR儀中95℃變性5 min后，立即置于冰水混合物中冷卻，然后對擴(kuò)增體系進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察統(tǒng)計條帶確定連鎖距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間調(diào)查結(jié)果

結(jié)果表明，父本08085全部為大花萼，母本08086為正常花萼，F(xiàn)1代為大花萼，F(xiàn)2代群體表現(xiàn)實際分離比為 3.175∶1，χ2檢測符合 3∶1 的分離比例。分析表明，所含的MC基因所控制的性狀是由單基因控制的性狀，結(jié)果見表1。

表1 番茄MC基因遺傳規(guī)律分析Table 1 Genetic analysis of MC gene in tomato

2.2AFLP標(biāo)記

2.2.1 引物篩選

利用父母本對488對引物進(jìn)行初步篩選，對篩選出的61對引物進(jìn)行混合池復(fù)選，得到多態(tài)性高的28對引物，結(jié)果見表2。

2.2.2 F2單株P(guān)CR擴(kuò)增

以08086×08085群體的334個F2單株DNA的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用這28對引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，并記錄譜帶。對每個標(biāo)記的帶型在F2群體中的分布進(jìn)行χ2測驗。

表2 用于群體F2單株選擇性擴(kuò)增的特異引物Table 2 Special primers used in amplication of F2individual plants of 08086×08085

利用Mapmarker 3.0軟件對該結(jié)果進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果表明，E65M63-D、E32M36-D和E47M75-A與MC基因的連鎖距離分別為5.1、7.2、12.3 cM。其中E65M63-D是有價值的分子標(biāo)記，可以作為分子輔助選擇的使用，結(jié)果見圖1。

2.3 種質(zhì)資源篩選

用本課題組提供的48份番茄材料為試材，進(jìn)行田間調(diào)查，得到番茄大花萼材料20份，同時運用AFLP標(biāo)記E65M63-D檢測，進(jìn)行AFLP標(biāo)記驗證分析，結(jié)果二者吻合度達(dá)91.7%，說明本試驗找到的番茄大花萼特異分子標(biāo)記可以用于番茄育種材料含MC基因的追蹤選擇。圖2為部分番茄材料的AFLP標(biāo)記檢測結(jié)果。

圖1 引物E65M63在部分F2單株中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplified products on AFLP primer of E65M63 on partial F2population

圖2 E65M63-D對部分材料的檢測結(jié)果Fig.2 Amplified products of AFLP primer E65M63-D on partial individual plants

3 討論

本試驗采用了穩(wěn)定成熟的AFLP標(biāo)記方法對番茄品質(zhì)性狀相關(guān)的大花萼突變體MC基因進(jìn)行研究，獲得了3個緊密連鎖的標(biāo)記，其中標(biāo)記E65M63-D遺傳距離為5.1 cM，是有價值的標(biāo)記。通過對48份番茄材料進(jìn)行標(biāo)記檢測，并結(jié)合田間調(diào)查，二者吻合率較高，證明了所獲得的標(biāo)記具有應(yīng)用價值。AFLP標(biāo)記的遺傳距離較遠(yuǎn)的原因可能是與選擇的父母親本的親緣關(guān)系有關(guān)，因此在選擇上應(yīng)選擇遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的配制雜交組合，這樣可以獲得更多的多態(tài)性標(biāo)記，有利于獲得更近的標(biāo)記。

對于試驗中出現(xiàn)的偏分離現(xiàn)象在幾乎所有類型的遺傳標(biāo)記都可見到[10]。分子標(biāo)記表現(xiàn)偏分離的原因是由于遺傳搭車效應(yīng)（Hitch hiking）和分子標(biāo)記與影響偏分離等位基因頻率的遺傳因子連鎖緊密。還有另外兩種假說解釋偏分離現(xiàn)象，一種假說認(rèn)為由于配子體選擇的緣故，F(xiàn)2群體出現(xiàn)偏分離的比例0∶2∶1（親本1∶正?！糜H本2）。另一種假說認(rèn)為是花粉選擇導(dǎo)致了0∶1∶1的偏分離[11]。還有人認(rèn)為偏分離現(xiàn)象是由于環(huán)境因素的影響。

本試驗的研究結(jié)果表明番茄大花萼突變體MC基因為顯性單基因控制的性狀，因此下一步的工作可將試驗獲得的標(biāo)記轉(zhuǎn)化為快捷、穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，對番茄種質(zhì)資源進(jìn)行準(zhǔn)確的含MC基因資源的篩選工作。利用含MC基因的品種配制雜交組合，通過基因工程技術(shù)把相應(yīng)的MC基因轉(zhuǎn)入植物的細(xì)胞中，利用細(xì)胞融合技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株，并將其應(yīng)用于番茄的育種中，加速番茄品質(zhì)育種進(jìn)程。

4 結(jié)論

本試驗利用含MC基因的08085為父本，正常材料08086為母本，及其有性雜交的F2分離世代的種子為試驗材料。對其F2進(jìn)行田間調(diào)查，調(diào)查鑒定結(jié)果表明符合3∶1的分離比率，說明MC基因是顯性單基因控制的。建立了穩(wěn)定的適合番茄基因組分析的AFLP反應(yīng)的技術(shù)體系。通過篩選488對AFLP引物，利用Mapmaker 3.0軟件處理數(shù)據(jù)，最終得到3個AFLP標(biāo)記與番茄大花萼MC基因連鎖，分別是E32M36-D、E65M63-D和E47M75-A，并計算得到它們與MC基因之間的遺傳距離分別為7.2、5.1、12.3 cM。應(yīng)用所獲得的遺傳距離較近的AFLP標(biāo)記E65M63-D對本課題組的48份番茄材料進(jìn)行分析鑒定，同時結(jié)合田間鑒定，結(jié)果AFLP分析與人工接種鑒定吻合率達(dá)91.7%，進(jìn)一步證明了AFLP標(biāo)記的應(yīng)用價值，為分子標(biāo)記輔助選擇育種打下基礎(chǔ)。

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