EDTA-K 2抗凝末梢血不同檢測時間對血小板計數(shù)結(jié)果的影響

梁委軍，董家書

（廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院柳州市工人醫(yī)院檢驗科，廣西 柳州 545005）

國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(ICSH)推薦使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)作為血細(xì)胞分析的抗凝劑廣泛使用于各個醫(yī)院，我們在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)一些標(biāo)本在采集樣本混勻后立即檢測血小板計數(shù)結(jié)果假性減少，低于100 g/L，而在混勻后再次檢測結(jié)果又在正常范圍內(nèi)，為探討其假性減少原因及采取解決對策，我們對2010年6月至2011年5月收集的62例標(biāo)本進(jìn)行采樣混勻后分別進(jìn)行即時檢測、2 min檢測、5 min檢測、10 min檢測，15～30 min檢測，同時以手工計數(shù)法為參照，評估儀器法在采血后不同時間檢測血小板計數(shù)的準(zhǔn)確性，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 ①儀器及試劑Sysmex XS-800I血液分析儀，試劑為Sysmex配套產(chǎn)品，定期參加衛(wèi)生部臨檢中心及區(qū)臨檢中心室間質(zhì)評，每日檢測之前儀器常規(guī)保養(yǎng)，本底計數(shù)正常，低、中兩個批號的質(zhì)控品檢測在控；EDTA-K2抗凝管，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)；一次性采血管，規(guī)格100μl，山東省成武縣醫(yī)用制品廠；手工法血小板稀釋液(草酸銨液)，參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[1]第3版配制。②樣本62例末梢血標(biāo)本來自門診病人，年齡7個月～76歲，男30例，女32例。

1.2 方法 用75%酒精消毒患者無名指，用一次性采血針刺破皮膚，拭去第一滴血后分別用一次性采血管(規(guī)格20 μl，100 μl)采集20 μl、滿管血樣分別置于0.38 ml手工血小板稀釋液中和EDTA-K2抗凝微管中并混勻，用XS-800I血細(xì)胞分析儀對經(jīng)EDTA-K2抗凝并混勻的末梢血標(biāo)本進(jìn)行即時檢測、2 min檢測、5 min檢測、10 min檢測、15～30 min檢測，分析血小板計數(shù)結(jié)果；手工計數(shù)方法嚴(yán)格參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版進(jìn)行，于30 min內(nèi)完成，將儀器法計數(shù)結(jié)果與手工計數(shù)結(jié)果比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 取各組參數(shù)的均數(shù)作統(tǒng)計學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析，SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

EDTA-K2抗凝末梢血不同檢測時間血小板計數(shù)結(jié)果分別為：即時檢測(142.71±57.45)×109；2 min檢測(206.65±78.04)×109；5 min檢測(203.08±82.52)×109；10 min檢測(211.56±68.85)×109；15～30 min檢測(200.66±70.20)×109；手工計數(shù)結(jié)果為(211.35±80.36)×109；經(jīng)方差分析，即時組與其他不同時間組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與手工計數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；其他不同時間組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與手工計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

血細(xì)胞分析儀計數(shù)血小板具有快速、簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，然而由于血小板易于粘附、聚集、破壞等諸多因素，導(dǎo)致血細(xì)胞分析儀測定血小板時常會出現(xiàn)假性減少，血小板可逆聚集[2]就是其中的一種，如不注意，易誘導(dǎo)臨床誤診誤治，甚至引起醫(yī)療糾紛。本文數(shù)據(jù)表明，采血混勻后立即經(jīng)XS-800I血液分析儀測定，血小板計數(shù)結(jié)果明顯偏低，與手工計數(shù)法及其他時間檢測的結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，分析原因：可能與血小板可逆聚集體的形成有關(guān)。當(dāng)血管壁受損后，會暴露出管壁的內(nèi)皮表面，內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的活性物質(zhì)和分泌釋放入血的活性成分迅即激活血小板，使活化的血小板表面糖蛋白成分、含量和構(gòu)象都發(fā)生了變化，由靜息狀態(tài)的圓盤狀轉(zhuǎn)變成骨架蛋白滑動后出現(xiàn)的多角形或多偽足形活化狀態(tài)[3]，誘導(dǎo)血小板聚集，這種由組織釋放的二磷酸腺苷(ADP)引起的第一時相為可逆性聚集；再者，新鮮末梢血離體后加入到EDTA-K2抗凝管中時，一定濃度的EDTA-K2絡(luò)合了血液中的鈣，在接觸血液后瞬間完全溶解，導(dǎo)致抗凝管內(nèi)壁周圍全血的外環(huán)境及溫度發(fā)生改變，血小板一旦與經(jīng)過特殊處理的抗凝管內(nèi)壁等非血管內(nèi)膜表面接觸，即迅速擴(kuò)展，顆粒向中央集中，血小板外膜形成的微小管游離端向外伸展，或因機(jī)動蛋白纖維絲向中心方向延長時遇到阻力而產(chǎn)生膜外方向的反作用推力，從而在血小板周圍形成多個絲狀偽足，使血小板形態(tài)發(fā)生變化，由正常兩面微凸的圓盤狀變?yōu)楸馄缴煺剐?，并出現(xiàn)明顯的胞漿突起使細(xì)胞變成有不規(guī)則“偽足”狀外突的樹突型血小板，數(shù)個偽足相互纏繞形成血小板聚集體[4]。

分析儀檢測血小板時以電阻脈沖形式計入，采血后立即檢測由于血小板發(fā)生聚集，其可逆聚集體不被溶血劑溶解，聚集體所產(chǎn)生的脈沖大于儀器預(yù)設(shè)的血小板脈沖值，血小板不被計入其結(jié)果內(nèi)或誤把一堆血小板計數(shù)成一個血小板，導(dǎo)致血小板數(shù)量暫時假性減少。鐘素萍等[5]曾報道，血標(biāo)本在采集后0.5 min檢測，血小板(PLT)計數(shù)值與手工計數(shù)差異顯著。由于樹突型血小板及時消除其刺激因素還能變成循環(huán)型血小板，采血過程中形成的血小板聚集體由于脫離了創(chuàng)傷面與抗凝劑結(jié)合，并經(jīng)操作者反復(fù)振蕩，通過振蕩這種物理作用，打散了血小板與血小板之間的粘附，使血小板聚集團(tuán)松散進(jìn)而解聚，大團(tuán)塊變成幾個小團(tuán)塊甚至瓦解，釋放粘附其中的血小板。汪兆亮等[6]報道末梢血混勻程度與靜置時間對血小板計數(shù)結(jié)果有很大影響，通過對末梢血采集后不振蕩立即檢測和充分振蕩混勻靜置5 min后檢測結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示未振蕩的計數(shù)值與充分振蕩混勻靜置5 min后的計數(shù)值差別甚大，前者比后者平均低30×109/L左右，認(rèn)為充分搖勻之后上機(jī)檢測結(jié)果穩(wěn)定性較好；而與抗凝劑絡(luò)合形成的聚集體隨著時間的延長及血液與抗凝劑的充分混勻，乙二胺四乙酸鹽使血小板由盤狀變?yōu)榍驙?，血小板偽足回縮到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，相互纏繞的血小板解散[7]，故在采血混勻2～30 min后進(jìn)行血細(xì)胞分析，可得到更加靠近真值的血小板計數(shù)結(jié)果，可提高結(jié)果準(zhǔn)確性。

實(shí)際操作中，門診患者(尤其是夜間急診患者)由于急需報告，檢驗人員通常會盡可能快地檢測，使標(biāo)本待測時間縮短，導(dǎo)致血小板結(jié)果偏低。本實(shí)驗中，第一次檢測發(fā)現(xiàn)血小板計數(shù)結(jié)果低于100 g/L的有11例；其中再次檢測結(jié)果正常的標(biāo)本有9例，占14.5%；2例再次檢測結(jié)果仍低于100 g/L，但較第一次檢測結(jié)果要高，1例再次檢測無變化，可認(rèn)為是真性減少；其余52例第一次檢測血小板雖然＞100 g/L，但與再次檢測后血小板計數(shù)結(jié)果相比，結(jié)果普遍都偏低。而充分混勻2 min后檢測與0.5 h內(nèi)檢測結(jié)果無太大差異，與手工計數(shù)法也無明顯差別，可見EDTA-K2抗凝末梢血在充分混勻2 min后檢測血小板數(shù)可基本消除血小板可逆性聚集的影響，因此末梢血采集后盡可能充分混勻兩分鐘后再檢測。值得一提的是，這種現(xiàn)象在冬天較為明顯，可能是血液與冰冷的抗凝劑接觸后溫度驟然降低，引起冷凝集所致，在影響血小板計數(shù)的因素中，冷凝集因素[8-9]也是其中之一。因此在遇到此類問題時最好重復(fù)檢測，必要時涂片鏡檢，避免血小板計數(shù)假性減少，給臨床造成極大的困擾。

[1]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].3版.南京:東南大學(xué)出版社,2006:10.

[2]李勝發(fā),程大林.血小板可逆聚集在全血細(xì)胞分析中的影響[J].臨床檢驗雜志,2003,21(1):37.

[3]許文榮,王建中.臨床血液血與檢驗[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:339.

[4]申志紅,楊宇溪.血小板可逆聚集致血細(xì)胞分析儀誤報血小板減少[J].臨床誤診誤治,2008,21(10):73.

[5]鐘素萍,馬粵健.Sysmex KX-21型血細(xì)胞分析儀計數(shù)血小板的影響因素的探討[J].海南醫(yī)學(xué),2007,18(8):132-133.

[6]汪兆亮,蔡敏琪,王湘云.末梢血混勻程度與靜置時間對血小板計數(shù)的影響[J].西南軍醫(yī),2006,8(6):51.

[7]叢玉隆.當(dāng)代血液分析技術(shù)與臨床[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1997:33-34.

[8]Kurata Y,Havashi S,Iouzaki K,et al.Four cases of pseudothrombocytopenia due to platelet cold agglutinins[J].Rinsho Ketsueki,2006,47(8):781-786.

[9]Schimmer A,Mody M,Sager M,et al.Platelet cold agglutinins:a flow cytometric analysis[J].Transfus Sci,1998,19(3):217-224.