葛渣總黃酮提取及葛根素含量測定

楊樹平，韓立軍，朱金衛(wèi)，許瑞波，蔣迎道

(1.淮海工學院化學工程學院，江蘇 連云港 222005；2.淮海工學院理學院，江蘇 連云港 222005)

葛渣總黃酮提取及葛根素含量測定

楊樹平1，韓立軍2，朱金衛(wèi)1，許瑞波1，蔣迎道1

(1.淮海工學院化學工程學院，江蘇 連云港 222005；2.淮海工學院理學院，江蘇 連云港 222005)

目的：優(yōu)化葛渣中總黃酮提取工藝條件，測定葛渣中葛根素含量。方法：以葛渣為原料、總黃酮得率為評價指標，采用L9(34)正交試驗設(shè)計，考察乙醇體積分數(shù)、提取時間、固料比、提取溫度對葛渣總黃酮提取效果的影響，同時采用高效液相色譜法(HPLC法)測定葛根素的含量。結(jié)果：葛渣中總黃酮的最佳提取工藝條件為以體積分數(shù)70%乙醇溶液為溶劑、提取150min、料液比1∶40(g/mL)、提取溫度80℃，此條件下的總黃酮得率最高，為32.41mg/g。在該提取條件下，葛根、葛渣和葛粉中總黃酮的含量分別為46.11、32.41mg/g和11.23mg/g；葛根、葛渣和葛粉中葛根素的含量分別為40.63、21.24mg/g和4.71mg/g。結(jié)論：葛渣中含有豐富的總黃酮和葛根素，該方法可作為從葛渣中提取總黃酮和葛根素的方法。

葛渣；總黃酮；葛根素；高效液相色譜法；正交試驗

葛根(Radiχ puerariae)為豆科植物野葛Pueraria lobata (wmd) Ohwi或甘葛藤P.thomsonii Benth的干燥根，具有解肌、退熱、生津、透疹、升陽、止瀉之功效，主要用于治療外感發(fā)熱、頭痛、高血壓等疾病[1]。作為常用的傳統(tǒng)中藥，葛根富含黃酮類化合物和淀粉，也是營養(yǎng)豐富的功能食品原料，已被國家衛(wèi)生部列入藥食同源的天然植物名單[2]。葛根中含有的異黃酮類物質(zhì)具有降低心肌耗氧量、增加冠狀動脈循環(huán)、緩解心絞痛、抗心律失調(diào)、增強肌體免疫力、生津止渴等多種藥理作用。其中葛根素為主要的有效成分，作為治療心腦血管的主要臨床用藥[3-7]。葛粉是葛根初級加工產(chǎn)品[8-11]。在鮮葛根制取葛粉的傳統(tǒng)工藝中大部分有效成分仍殘留在葛渣中，葛渣常常被丟棄不用或作為造紙原料，造成葛根資源的浪費。因此，從“廢渣”中獲得葛根總黃酮及葛根素，為葛根資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葛渣來自江蘇省連云港市云臺山區(qū)葛根制取葛粉后的殘渣(自然晾干，粉碎)，葛根采自江蘇省連云港市云臺山，葛粉購自當?shù)爻小?/p>

葛根素對照品 中國藥品生物制品檢定所；乙醇、石油醚等均為分析純，甲醇為光譜純。

DF-1型集熱式磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；電熱鼓風干燥器浙江舟山市定海區(qū)海源儀器廠；BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；UV-2550型紫外分光光度計、LC-10AVP高效液相色譜儀 日本島津公司；XA-1固體樣品粉碎機 金壇市科興儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液及供試品溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葛根素對照品10.1mg于100mL容量瓶中，用體積分數(shù)95%乙醇溶解并定容，制備成0.1mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液的制備：取葛渣粉末(60目)1g，置于100mL圓底燒瓶中，加入石油醚20mL，加熱回流1h進行脫色，過濾棄去濾液，如此重復(fù)1次，殘渣揮干溶劑后，按照正交試驗設(shè)計表(表2)中設(shè)定的提取條件進行總黃酮的提取，過濾，合并濾液，減壓濃縮至原體積的1/4，用95%乙醇定容于100mL容量瓶中，作為供試品溶液待測。

1.2.2 總黃酮的測定

1.2.2.1 檢測波長的選擇

精密移取對照品溶液和供試品溶液各1.0mL分別置10mL的容量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻，以95%乙醇作為空白對照，在200～400nm波長范圍分別進行紫外吸收掃描，最大吸收均出現(xiàn)在250nm附近(圖1)，故選250nm為檢測波長。

圖1 葛根素對照品和葛渣供試品吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra of puerarin standard and Radix Puerariae residue extract

1.2.2.2 標準曲線的繪制

精密量取葛根素對照品溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL，分別置于10mL容量瓶中，用95%乙醇溶液定容，搖勻靜置10min后，以95%乙醇溶液作為空白對照，于波長250nm處測定吸光度，以吸光度Y為縱坐標、葛根素質(zhì)量濃度X/(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=84.5180X-0.1334，R2=0.9996。結(jié)果顯示，葛根素對照品質(zhì)量濃度在0.01～0.05mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。方法精密度RSD為0.85%，方法重復(fù)性RSD為0.34%，穩(wěn)定性實驗RSD為0.99%，樣品液在8h內(nèi)穩(wěn)定，方法回收率為98.25%，RSD為1.73%。

1.2.2.3 精密度實驗

精密吸取同一濃度的葛根素對照品溶液，重復(fù)測定5次，吸光度平均值為0.6952，RSD為0.85%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

1.2.2.4 穩(wěn)定性實驗

精密吸取同一供試品溶液，在0、2、4、6、8h測定，吸光度平均值為1.2442，RSD為0.99%，結(jié)果表明本品8h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

1.2.2.5 重復(fù)性實驗

精密稱取葛渣樣品5份，每份1g，按1.2.1節(jié)供試品溶液制備方法制成供試品液(6號提取條件)測定吸光度，吸光度平均值為2.6061，RSD為0.34%，結(jié)果表明本法具有良好的重復(fù)性。

1.2.2.6 準確度實驗

精密稱取已知總黃酮含量的葛渣樣品5份，每份0.1g，每份加入質(zhì)量濃度為0.101mg/mL的對照品溶液3mL，按1.2.1節(jié)操作制成供試品溶液，直接測定吸收度，計算回收率，平均回收率為98.25%，RSD為1.73%，結(jié)果表明總黃酮回收率良好，該方法準確度較好，可行性強。

1.2.2.7 樣品總黃酮含量的測定

精密移取供試品溶液1mL置于10mL容量瓶中，用95%乙醇溶液定容，以95%的乙醇作空白參比，于波長250nm處測定吸光度，按1.2.2.2節(jié)標準曲線的繪制項下的回歸方程計算供試品液中總黃酮質(zhì)量濃度，并計算樣品總黃酮得率。

1.2.3 正交試驗設(shè)計

以葛渣總黃酮得率為評價指標，乙醇體積分數(shù)(A)、提取時間(B)、料液比(C)、提取溫度(D)為試驗因素進行正交設(shè)計，因素水平見表1，選用L9(34)正交試驗設(shè)計表進行正交試驗，優(yōu)化葛渣中總黃酮的提取工藝，正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.2.4 高效液相法測定葛根素含量[12-13]

1.2.4.1 色譜條件

色譜柱：C18ODS柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相梯度洗脫：其中0～10min為50%甲醇，10～15min為75%甲醇溶液，15～20min為50%甲醇溶液，之后運行5min；檢測波長：250nm；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL；柱溫：室溫。

1.2.4.2 標準曲線的繪制

精密量取葛根素對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻靜置10min后，分別進樣20μL，于波長250nm處測定吸收峰面積，以吸收峰面積Y為縱坐標、葛根素質(zhì)量濃度X/(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝1702.9X＋4668.2，R2＝0.9997。結(jié)果顯示，葛根素質(zhì)量濃度在10.1～50.5μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.4.3 精密度實驗

精密吸取同一濃度對照品溶液20μL，在上述色譜條件下測定，重復(fù)進樣5次，峰面積RSD為1.12%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

1.2.4.4 穩(wěn)定性實驗

精密吸取同一供試品溶液20μL，按上述色譜條件，分別于0、2、4、6、8h進樣測定，峰面積RSD為1.23%，結(jié)果表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.4.5 重現(xiàn)性實驗

精密稱取葛渣樣品5份，按1.2.1節(jié)供試品溶液制備方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下測定，峰面積RSD為0.69%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

1.2.4.6 回收率實驗

精密稱取已知葛根素含量的葛渣樣品5份，每份0.1g，每份加入質(zhì)量濃度為0.101mg/mL的對照品溶液3mL，按1.2.1節(jié)供試品溶液制備方法制成供試品溶液，精密吸取20μL進樣，在上述色譜條件下測定峰面積，計算回收率，平均回收率為98.44%，RSD為1.64%，表明葛根素回收率良好，該方法準確度較好，可行性強。

1.2.4.7 樣品葛根素含量的測定

精密移取供試品溶液1mL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，在上述色譜條件下，進樣20μL，測定峰面積，按1.2.4.2節(jié)標準曲線的繪制項下回歸方程計算供試品液中葛根素質(zhì)量濃度，并計算樣品中葛根素含量。

1.2.5 葛根、葛渣、葛粉樣品中總黃酮和葛根素含量比較

在最佳提取工藝條件下，即乙醇體積分數(shù)70%、提取時間150min、料液比1∶40(g/mL)，提取溫度80℃，將葛根、葛渣、葛粉按1.2.1節(jié)供試品溶液制備方法分別制成供試品溶液，按1.2.2.7節(jié)樣品總黃酮含量測定方法測定并計算總黃酮含量，按1.2.4.7節(jié)樣品葛根素含量測定方法測定并計算葛根素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮提取工藝正交試驗

表2 總黃酮提取L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results

表2表明，各因素對提取效果的影響程度為提取溫度＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞液固比，其中提取溫度對葛渣總黃酮的提取效果影響最大，而料液比對提取效果無顯著影響。葛渣總黃酮的最佳提取工藝為A2B3C3D2，即70%乙醇溶液、提取150min、料液比1∶40、提取溫度80℃。

在最佳優(yōu)化工藝條件進行3次平行驗證實驗，葛渣總黃酮分別為32.32、32.52、32.40mg/g，RSD為0.31%，總黃酮的平均含量為32.41mg/g，重現(xiàn)性較好，可見該工藝穩(wěn)定可行。

2.2 葛根、葛渣、葛粉中總黃酮及葛根素含量比較

表3 葛根、葛渣和葛粉總黃酮及葛根素含量對比Table 3 Contents of total flavonoids and puerarin in Radix Puerariae, Radix Puerariae residue and pueraria root powder

黃酮是葛根的主要活性成分，其含量是衡量葛根質(zhì)量的重要指標，傳統(tǒng)方法制備的葛粉中總黃酮含量較少，一部分總黃酮在葛粉加工過程中流失。通過含量比較實驗，由表3可知，連云港市云臺山地區(qū)葛根中總黃酮的含量較高為46.11mg/g，葛渣中總黃酮含量達32.41mg/g，而葛粉中總黃酮含量僅為11.23mg/g，即在制取葛粉過程中，葛根中黃酮成分的70.29%殘留在葛渣中，僅有24.36%黃酮成分留在葛粉中，有近5.35%的黃酮成分在葛粉的制備過程中流失。

葛根素為葛根總黃酮中主要成分，是葛根總黃酮產(chǎn)品的一個重要指標，通過比較，由表3可知，連云港云臺山地區(qū)葛根中葛根素的含量較高，為40.63mg/g，而葛渣中葛根素含量為21.24mg/g，葛粉中葛根素含量近4.71mg/g。也就是說，在制取葛粉中過程中，葛根中葛根素成分的52.29%殘留在葛渣中，僅有11.60%葛根素成分存在于葛粉中，還有近36.11%的葛根素成分在葛粉的制備過程中流失掉落。

如果葛渣被直接丟棄而不被利用，葛根中約75.6%黃酮成分或者約52.29%葛根素成分被白白扔掉而未被利用，造成葛根資源的極大浪費。同時，葛粉中功能性成分含量較少，葛粉傳統(tǒng)制備方法值得商榷，以避免資源的過度浪費。

3 結(jié) 論

葛渣總黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)70%、提取時間150min、料液比1∶40(g/mL)、提取溫度80℃。葛渣總黃酮得率為32.41mg/g。

連云港云臺山地區(qū)葛根、葛渣、葛粉中總黃酮的含量分別為46.11、32.41mg/g和11.23mg/g，葛根素的含量分別為40.63、21.24mg/g和4.71mg/g，即在制取葛粉中，葛根中大約70.29%的黃酮成分或52.295%葛根素留在葛渣中，可從生產(chǎn)葛粉的“廢渣”中獲得葛根黃酮及葛根素。

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Optimization of Total Flavonoids Extraction from Radiχ Puerariae and HPLC Determination of Puerarin

YANG Shu-ping1，HAN Li-jun2，ZHU Jin-wei1，XU Rui-bo1，JIANG Ying-dao1
(1. School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. School of Mathematics and Science, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

In this paper, orthogonal array design L9(34) was employed to optimize the extraction conditions of total flavonoids from Radiχ Puerariae residue left after pueraria root powder extraction. The effects of extraction temperature, ethanol concentration, extraction time and material-to-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids were probed. Meanwhile, a HPLC method to determine puerarin content in Radix Puerariae was presented based on optimized extraction process. The optimal extraction conditions were determined as follows∶ ethanol concentration 70%, reflux time 150 min, reflux temperature 80 ℃, and material-to-liquid ratio 1∶40, under which, the contents of total flavonoids in Radiχ Puerariae, Radiχ Puerariae residue and pueraria root powder were 46.11, 32.41 mg/g and 11.23 mg/g, and of puerarin 40.63, 21.24 mg/g and 4.71 mg/g, respectively. From these results, we drew the conclusion that Radix Puerariae residue is rich in total flavonoids and puerarin and that the optimized extraction process can be used for the extraction of total flavonoids and puerarin from Radiχ Puerariae residue.

Radiχ Puerariae residue；total flavonoids；puerarin；high performance liquid chromatography；orthogonal array design

R284.2

A

1002-6630(2011)14-0303-04

2010-10-03

江蘇省海洋資源開發(fā)研究院科技開放基金課題(JSIMR09D02)；淮海工學院自然科學基金項目(KX10019)；淮海工學院引進人才啟動基金項目(KK01064)

楊樹平(1960—)，女，副教授，學士，主要從事藥物化學研究。E-mail：spyang69320@yahoo.cn