豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的檢測

楊 勇，周小平，秦 丹，程 燕

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的檢測

楊 勇，周小平，秦 丹，程 燕

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳檢測豬肉乳化香腸中的大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)。結(jié)果顯示，大豆蛋白主要有5條蛋白條帶(β-大豆伴球蛋白中的d1、α'、β、d2亞基和大豆球蛋白的d3亞基) 能和豬肉的蛋白條帶區(qū)分開；其中，獲得了由α'亞基蛋白條帶的光強(qiáng)度值與SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算得到的一個線性回歸方程，該方程作為檢測豬肉乳化香腸中SPI添加量(0.5%～10%)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)用得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線預(yù)測已知SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)(7%、3%、1.5%、0.8%、0.5%)的豬肉乳化香腸，結(jié)果證明該方法具有很好的重復(fù)性(變異系數(shù)1.90%～7.01%)。同時將SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測值和真實(shí)值進(jìn)行線性回歸分析，得到相關(guān)系數(shù)為0.98，證明了這種檢測方法能應(yīng)用于豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的定量檢測。

豬肉乳化香腸；大豆分離蛋白；檢測；聚丙烯酰胺凝膠電泳

豬肉乳化香腸是近年來國內(nèi)市場上具有典型代表性的西式肉制品，如法蘭克福香腸、維也納香腸、斯特拉斯堡早餐腸等。國內(nèi)生產(chǎn)的乳化香腸主要采用豬肉為原料，輔之以食鹽、腌制劑、調(diào)味料、大豆分離蛋白等，并經(jīng)過斬拌(乳化)、干燥、煙熏、蒸煮等工藝而制得，因其肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富、食用方便等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者的歡迎[1-2]。然而，到目前為止，國內(nèi)外對肉制品中大豆蛋白的檢測還沒有確定的法定方法。而一些生產(chǎn)商為了獲得更多的經(jīng)濟(jì)利益，在肉制品中加入過多價格較低的大豆蛋白來的減少肉的添加量，且不在成分表中說明其含量，這種行為不僅導(dǎo)致商家不公平競爭，同時，對于消費(fèi)者來說也不能基于其成分做出購買選擇[3-6]。因此，許多國家禁止添加大豆蛋白或者只允許有限度的添加大豆蛋白，如美國法律規(guī)定在香腸中大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)含量不能超過2%[7]。但目前國內(nèi)在肉制品中大豆蛋白應(yīng)用方面還沒有頒布相關(guān)規(guī)范，也未制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，因此，開發(fā)快速、簡便、穩(wěn)定性強(qiáng)的大豆蛋白檢測方法，對于規(guī)范大豆蛋白的使用，保障消費(fèi)者利益具有重要意義[6]。

目前國外檢測肉制品中大豆蛋白的檢測方法主要有ELISA法、高效液相色譜法、電泳法等。ELISA法是目前實(shí)驗(yàn)室常用于大豆蛋白檢測的方法，但美國化學(xué)分析協(xié)會只是將它作為一種半定量的方法[8]。高效液相色譜法是一種分離蛋白質(zhì)的常用方法，然而，應(yīng)用該方法在分離檢測肉制品中大豆蛋白時，操作復(fù)雜且成本較高[7]。聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)是研究大豆蛋白最普遍的電泳方法，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于食品的處理過程(特別是熱處理)對檢測影響很小[9]。Molander[10]應(yīng)用SDS-PAGE電泳法檢測肉制品中大豆蛋白的含量，檢出限達(dá)0.6%；Lee等[11]成功通過SDS-PAGE電泳法檢測了肉和大豆蛋白混合物(未加熱和加熱處理)中大豆蛋白的含量。然而，這種方法目前還沒有應(yīng)用到檢測乳化香腸中的大豆分離蛋白。因此，本研究利用SDS-PAGE電泳法對豬肉乳化香腸中的大豆分離蛋白進(jìn)行分析檢測，目的是將SDS-PAGE用于豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的定量檢測，并確定其檢出范圍及檢出限。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 山東德州大王集團(tuán)蛋白食品有限公司；豬后腿肉、豬脂肪、淀粉、食鹽、白沙糖、葡萄糖、味精、白胡椒粉、十三香 雅安當(dāng)?shù)爻校划怴C鈉、紅曲色素、磷酸鹽、亞硝酸鈉 食品添加劑市場；豬腸衣 自備。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS24電熱恒溫水浴鍋、DHG29345A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒公司；QT-2旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；Mini垂直電泳儀、ChemiDoc XRS凝膠成像儀 美國Bio-rad公司；Bellitouron 53200高速冷凍離心機(jī) 法國Thermo Electron公司；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；BCD2186E1B海爾冰箱；PB210 pH計 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 豬肉乳化香腸配方及加工工藝[12]

主料(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：豬后腿瘦肉(50%)、按SPI(10%、5%、2%、1%、0.5%、0%)制備用于檢測SPI的標(biāo)準(zhǔn)曲線的豬肉乳化香腸；同時按SPI(7%、3%、1.5%、0.8%、0.5%)制備用于驗(yàn)證該方法的豬肉乳化香腸。

配料(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：豬脂肪(18%)、碎冰(19%)、淀粉(2%)、水(1%)、食鹽(1.9%)、白沙糖(0.5%)、葡萄糖(0.5%)、味精(0.15%)、磷酸鹽(0.3%)、亞硝酸鈉(0.015%)、白胡椒粉(0.015%)、十三香(0.01%)、異VC鈉(0.03%)、紅曲色素(0.0007%)。

工藝流程：原料豬后腿肉→選修→加SPI、配料進(jìn)行斬拌、乳化→灌腸→40℃干燥 5 min→55℃干燥10min→80℃蒸煮30min→噴淋冷卻 →冷藏。

1.3.2 樣品處理

參考 Guy等[13]和王振宇等[14]的方法稍作修改，稱取豬后腿瘦肉、大豆分離蛋白、配料、不同SPI的自制豬肉乳化香腸各10.00g，研磨均勻，分別取1.00、0.20、0.80、2.00g，放入不同編號的50mL離心管中，再各添加30mL緩沖液(緩沖液由8mol尿素和10g硫基乙醇加蒸餾水至1L配制而成)，用玻璃棒攪拌均勻，旋渦混合器混合3min，4℃，10000×g離心20min， 上清液用whatman 1#濾紙在4℃條件下過濾除去上浮脂肪，濾液為蛋白提取液。

1.3.3 SDS-PAGE凝膠電泳

參考LaemmLi等[15]和Molander[10]的方法，按分離膠11%，濃縮膠4%進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.3.4 定量檢測

電泳完成后，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色30min，取100mL脫色液對分離膠脫色，重復(fù)脫色3次，在600nm波長處進(jìn)行掃描，用光強(qiáng)度的值來定量檢測大豆蛋白條帶[10,16]。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用Quantity one軟件對凝膠結(jié)果進(jìn)行分析，Origin 8.0制圖，SPSS 18.0對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析豬肉乳化香腸中的大豆分離蛋白和豬肉蛋白

圖1 無配料含不同SPI添加量的模擬豬肉乳化香腸SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE patterns of pork, soybean, auxiliary materials for emulsion-type pork sausages and mimic emulsion-type pork sausages containing different amounts of SPI and no auxiliary materials

圖2 含不同SPI添加量的豬肉乳化香腸的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE patterns of pork, soybean, auxiliary materials for emulsion-type pork sausages and emulsion-type pork sausages containing different amounts of SPI and auxiliary materials

圖1、2顯示了豬肉、SPI、配料及SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同的豬肉乳化香腸的SDS-PAGE電泳圖。從圖1、2可以看出，大豆分離蛋白主要有5條(d1，α'，β，d2，d3)蛋白條帶能和豬肉的蛋白條帶區(qū)分開，但d1和d2兩條蛋白帶由于含量較低，在大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時不能被檢測到。5條大豆分離蛋白區(qū)分帶中有3條(α'、β、d3)蛋白條帶與Molander[10]發(fā)現(xiàn)的一致。大豆蛋白中的β-大豆伴球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)是大豆貯藏蛋白中的兩種主要蛋白質(zhì)，其含量大約分別占大豆貯藏蛋白的40%和25%[17]。圖1中α'、β為β-大豆伴球蛋白(7S)的兩個亞基，分子質(zhì)量分別為82kD和48kD，d3為大豆球蛋白(11S)的一種亞基，分子質(zhì)量為19kD。Lee[18]等研究指出了19.5kD的大豆蛋白條帶不會被其他多種非肉蛋白(牛奶蛋白、花生蛋白、雞蛋蛋白等)干擾，和本研究中發(fā)現(xiàn)的d3(19kD)蛋白條帶一致。同時從圖1和圖2還可以看到，豬肉蛋白條帶中主要有7條(r1～r7)蛋白條帶和大豆蛋白條帶區(qū)分開，其中一條45kD的豬肉蛋白條帶(G-肌動蛋白)與Hofmann[19]研究的結(jié)果一致，同時發(fā)現(xiàn)這條蛋白在加工前后仍大量存在，但有明顯的降低，這與王振宇[14]研究的純豬肉在80℃條件下加熱幾乎未降解存在差異，可能是由于本實(shí)驗(yàn)中蛋白含量比較低，降解較明顯。從圖1、2還發(fā)現(xiàn)了一條接近24kD的肌鈣蛋白(r5)，這與Chen等[20]發(fā)現(xiàn)的24kD熱穩(wěn)定蛋白一致，據(jù)研究這種蛋白在126℃加熱120min幾乎不分解，同時對其溶解度和免疫學(xué)功能均無影響。

2.2 定量分析豬肉乳化香腸中的大豆分離蛋白

由于蛋白的量與所吸附的考馬斯亮藍(lán)大致呈正比，遵循Beer-Lambert定律[21]，同時，根據(jù)Molander[10]和Lee等[11]的研究，在一定濃度范圍內(nèi)，同一蛋白條帶的光強(qiáng)度值和大豆蛋白添加量之間存在線性關(guān)系，通過比較其相關(guān)系數(shù)，可以得到檢測大豆分離蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1、2可以發(fā)現(xiàn)，在大豆分離蛋白區(qū)分帶中，3條(α'、β、d3)蛋白條帶在SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～10%之間都能被很好的檢測到。比較由這三條(α'、β、d3)蛋白條帶的光強(qiáng)度值隨SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的變化(圖3)，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～10%時，α'、β蛋白條帶的光強(qiáng)度值隨SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈較好的線性(圖3)，而當(dāng)SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%～10%時，d3蛋白條帶的光強(qiáng)度值隨SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加逐漸趨于水平(圖3)。為了得到定量分析豬肉乳化香腸中SPI的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算3條蛋白條帶(α'、β、d3)的光強(qiáng)度值與SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的線性相關(guān)系數(shù)，得到的相關(guān)系數(shù)分別為0.9868、0.9789、0.8333。由于α'亞基蛋白條帶(線性R2=0.9868)線性相關(guān)系數(shù)最好，因此作為檢測豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，應(yīng)用SPSS 18.0分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y峰面積=99.0291X＋618.5902，Y峰面積為α'亞基蛋白條帶的光強(qiáng)度值，χ為豬肉乳化香腸中SPI的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖3 不同SPI添加量的豬肉乳化香腸中蛋白條帶的光強(qiáng)度圖(n=3)Fig.3 SDS-PAGE band intensities of β-conglycinin α＇ andβ subunits and glycinin d3subunit versus SPI amount (n=3)

圖4 由α＇亞基計算得到的檢測SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(n=3)Fig.4 Standard curve for the determination of SPI by regression analysis based on α' subunit

2.3 檢測大豆分離蛋白的添加量

為了驗(yàn)證該標(biāo)準(zhǔn)曲線能否用于定量檢測豬肉乳化香腸中的SPI，通過由α'亞基蛋白條帶計算得到的(SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～10%之間)檢測豬肉乳化香腸中SPI的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)來預(yù)測未知樣品中的SPI的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(圖2中5～9泳道，圖4)。表1展示了樣品中SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)的真實(shí)值和預(yù)測值，結(jié)果表明，預(yù)測的SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近真實(shí)SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)，低變異系數(shù)(1.90%～7.01%)證明該方法具有很好的重復(fù)性。

表1 豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的真實(shí)值和由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的預(yù)測值Table 1 Predicted and actual values of SPI in emulsion-type pork sausages

圖5 大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測值和真實(shí)值之間的回歸分析Fig.5 Regression analysis between predicted values and actual values of SPI

設(shè)定置信區(qū)間為95.0%，對大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測值和真實(shí)值進(jìn)行線性回歸分析[22]。圖5顯示了預(yù)測值和真實(shí)值之間的相關(guān)系數(shù)為0.98，非常接近1，這就說明了預(yù)測值和真實(shí)值之間非常的接近。通過這些結(jié)果，證明了這種檢測方法能應(yīng)用于豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的定量檢測。

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用SDS-PAGE電泳對豬肉乳化香腸中豬肉和大豆分離蛋白進(jìn)行分析檢測，獲得了一條能定量檢測豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白(0.5%～10%)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其最低檢出限為0.5%。通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線成功用于豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的預(yù)測，證明該方法能被有效地應(yīng)用于豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的檢測。

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Determination of Soybean Protein Isolate in Emulsion-type Pork Sausages

YANG Yong，ZHOU Xiao-ping，QIN Dan，CHENG Yan
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was used for the qualitative and quantitative analysis of soybean protein isolate (SPI) in emulsion-type pork sausages. Results showed that SPI displayed five major bands including β-conglycinin d1, α', β and d2subunits and glycinin d3 subunit in SDS-PAGE, which could be distinguished from pork protein. A linear regression equation with band intensity as a function of SPI concentration of α' subunit in the range of 0.5%-10% was obtained for determining SPI in emulsion-type pork sausages. The prediction values of samples containing SPI at various amounts of 7%, 3%, 1.5%, 0.8% and 0.5% exhibited a high reproducibility with variation coefficients between 1.90% and 7.01%. The successful application of SDS-PAGE was also demonstrated by a high correlation coefficient of 0.98 obtained from regression analysis between the predicted and actual values of SPI in spiked emulsion-type pork sausages.

emulsion-type pork sausages；soybean protein isolate；determination；sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

TS251.7

A

1002-6630(2011)14-0281-04

2010-10-21

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“雙支計劃”課題(06070105)

楊勇(1969—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)與技術(shù)。E-mail：yangyong676@163.com