蘆根多糖的超聲輔助提取及其抗菌活性

姚以才，耿中華，王乃馨，鄭 義，李 超

(徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221000)

蘆根多糖的超聲輔助提取及其抗菌活性

姚以才，耿中華，王乃馨，鄭 義，李 超*

(徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221000)

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗優(yōu)化超聲輔助提取蘆根多糖的最佳工藝條件，然后研究蘆根多糖抗菌活性。結果表明，超聲輔助提取蘆根多糖的最佳工藝條件為液料比9.9∶1(mL/g)、超聲溫度60℃、超聲時間52min，此時蘆根多糖得率9.06%；超聲輔助提取獲得的蘆根多糖對酵母菌屬于極敏感，對金黃色葡萄球菌屬于高敏感，對枯草芽孢桿菌和黑曲霉屬于中敏感。

蘆根；多糖；超聲輔助提取；抗菌活性

蘆根(Rhizoma phragmitis)為禾本科多年生草本植物蘆葦?shù)男迈r或干燥根莖，性寒、味甘，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱、生津、除煩、止嘔、利尿之功效[1]。臨床主要用于發(fā)燒、尿路感染、肺膿瘍、支氣管炎等病的治療[2]。近來報道，多糖為其主要活性成分，其具有免疫促進作用，促進淋巴細胞轉化，抗氧化以及護肝等生理活性[3-5]。目前，蘆根多糖在醫(yī)藥品、保健用品、保健食品領域中的應用越來越廣泛，但對蘆根多糖的超聲輔助提取尚未見報道。超聲提取作為一種優(yōu)良的提取方法，具有操作簡便快捷、提取時間短、提取率高等特點，目前己廣泛應用于生物活性物質提取[6-11]。本實驗對蘆根多糖的超聲提取及抗菌活性進行研究，旨在為蘆根多糖的進一步研究與開發(fā)應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆根 安徽亳州藥材市場；葡萄糖、乙醇、苯酚、濃硫酸等均為分析純；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉(Aspergillumniger)、酵母菌(Saccharmoyces cerevisiae) 本實驗室分離；金黃色葡萄球菌(Staphy lococcus aureus) 廣州市微生物研究所。

1.2 儀器與設備

FA2004型電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司；KBS-250型數(shù)控超聲波細胞粉碎機 昆山市超聲儀器有限公司；SENCO R201L型旋轉蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；HH-4型電熱恒溫水浴鍋 上海梅向醫(yī)療器械廠；7230G型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲輔助提取

蘆根粉碎后過40目篩，精確稱取約3g，置于燒杯中，加入一定體積一定體積分數(shù)乙醇溶液后，按照試驗設計設置好超聲功率、超聲溫度和超聲時間(占空比固定為5s/5s)后開動超聲制樣，然后將提取液過濾，定容至100mL，測定。

1.3.2 標準曲線的建立[12]

按文獻[12]方法稍加修改：精密稱取葡萄糖125mg，定容至50mL，分別精密量取0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL至25mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，取此系列溶液各2mL至10mL具塞試管中，分別向上述試管中精密加入1mL 5%苯酚乙醇溶液、5mL濃硫酸，搖勻，置100℃水浴中反應15min，反應完畢后取出，放置至室溫，于紫外490nm處測定吸光度。以葡萄糖溶液質量濃度為橫坐標、其相應的吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線：標準曲線為A=17.949C-0.017(R2= 0.9977)，其在0～0.25mg/mL之間線性良好。

1.3.3 工藝優(yōu)化設計

1.3.3.1 單因素試驗

考察乙醇體積分數(shù)、液料比、超聲功率、超聲溫度和超聲時間對蘆根多糖得率(extraction yield，EY)的影響。

1.3.3.2 Box-Behnken試驗

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，選取液料比、超聲溫度和超聲時間3個影響因素，采用3因素3水平的響應曲面分析方法，試驗因素與水平設計見表1。共15個試驗點，其中12個為析因點，3個為中心點。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in Box-Behnken experimental design

設該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為：

式中：EY為預測響應值；χi和χj為自變量代碼值；β0為常數(shù)項；β為線性系數(shù)；βij為交互項系數(shù)；βii為二次項系數(shù)；ε為隨機誤差。按照Box-Behnken試驗設計的統(tǒng)計學要求，對上述方程的各項回歸系數(shù)進行回歸擬合。

1.3.4 蘆根多糖得率的計算

1.3.5 抑菌試驗

1.3.5.1 培養(yǎng)基制備

枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌使用LB培養(yǎng)基，黑曲霉使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，酵母菌使用YPD培養(yǎng)基[13]。

1.3.5.2 菌懸液制備

枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌菌懸液的制備：將各菌種在固體培養(yǎng)基中活化，用接種環(huán)挑取2～3環(huán)培養(yǎng)18h左右的菌種，接入液體培養(yǎng)基中，在恒溫搖床中培養(yǎng)18h得到菌懸液，把菌懸液濃度調為106～107個/mL，備用。

黑曲霉菌懸液的制備：用滅菌的蒸餾水倒入培養(yǎng)72h左右的斜面接種試管中振蕩，再把液體倒入三角瓶中作為孢子懸液，把菌懸液濃度調為106～107個/mL，備用。

1.3.5.3 抑菌活性的測定

以超聲輔助提取的蘆根多糖為抗菌液(多糖質量濃度15mg/mL)，待培養(yǎng)皿中的含菌培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子在每個培養(yǎng)基的表面均勻垂直地放上牛津杯，然后在其中加入等量抗菌液。細菌在37℃培養(yǎng)24h，真菌在28℃培養(yǎng)48h，霉菌在28℃培養(yǎng)5d，測定抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)的影響

圖1 乙醇體積分數(shù)對蘆根多糖得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polysaccharides from Rhizoma phragmitis

由圖1可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，蘆根多糖得率一直降低，使用水作為溶劑時，蘆根多糖得率達到了最大值。這是因為多糖為極性較大的化合物，根據(jù)相似相溶原理，水作為提取劑的極性與此多糖的極性更加接近，從而使蘆根多糖得率最大。因此選擇提取劑為水。

2.1.2 液料比的影響

由圖2可知，隨著液料比的增加，蘆根多糖得率先增加后降低，在液料比10∶1時蘆根多糖得率達到最大值。這是因為前期溶劑量越大，有效成分浸出越完全，蘆根多糖得率也越大；但當溶劑過大時，探頭式超聲能量對沉滯低層的蘆根顆粒的空化效應和機械效應等效應的強度減弱，影響了超聲輔助提取的效果，同時會造成溶劑和能源的浪費，并給后序的濃縮工作帶來困難。因此選擇液料比10∶1。

圖2 液料比對蘆根多糖得率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of polysaccharides from Rhizoma phragmitis

2.1.3 超聲功率的影響

圖3 超聲功率對蘆根多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharides from Rhizoma phragmitis

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，蘆根多糖得率先增加后降低，在超聲功率為100W時，蘆根多糖得率達到最大值。這是因為前期超聲功率增加，提取的推動力增加，但當超聲功率達到100W以上時，可能由于超聲功率過大，多糖受到破壞，導致蘆根多糖得率下降。同時考慮到KBS-250型數(shù)控超聲波細胞粉碎機設備的特點，固定超聲功率100W。

2.1.4 超聲溫度的影響

由圖4可知，隨著超聲溫度的增加，蘆根多糖得率先增加后降低，在超聲溫度60℃時，蘆根多糖得率達到最大值。這是因為前期溫度增加增加了傳質速度；但超過60℃之后，多糖受到破壞，同時造成溶劑揮發(fā)損失。因此選擇超聲溫度60℃。

圖4 超聲溫度對蘆根多糖得率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharides from Rhizoma phragmitis

2.1.5 超聲時間的影響

圖5 超聲時間對蘆根多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of polysaccharides from Rhizoma phragmitis

由圖5可知，隨著超聲時間增加，蘆根多糖得率也隨之增大；但當超聲時間達到50min以后，可能由于超聲時間過長，多糖受到了破壞，導致蘆根多糖得率下降，因此選擇超聲時間50min。

2.2 Box-Behnken試驗

2.2.1 模型的建立及其顯著性檢驗

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results

利用Design expert V7.0.0統(tǒng)計軟件通過逐步回歸對表2試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到蘆根多糖得率對以上3個因素的二次多項回歸模型為：

表3 響應曲面二次回歸方程模型方差分析結果Table 3 Variance analysis for the developed quadratic regression model

由該模型方差分析(表3)可見：模型具有極顯著性(P＜0.01)，失擬項(P＞0.05)不顯著以及R2Adj=0.9740和RSN=21.882，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，實驗誤差較小，故可用此模型對超聲輔助提取蘆根多糖的工藝結果進行分析和預測。

2.2.2 響應曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，作響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析液料比、超聲溫度和超聲時間對蘆根多糖得率的影響。其響應曲面及其等高線如圖6所示，3組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響。

比較3組圖并結合表3中P值可知：模型的一次項χ1(P＜0.05)極顯著，χ3(P＜0.05)顯著，χ2(P＞0.05)不顯著；交互項都不顯著；二次項χ12(P＜0.01)、x22(P＜0.01)和χ32(P＜0.01)都極顯著，表明各影響因素對蘆根多糖得率的影響不是簡單的線性關系。為進一步確定最佳提取工藝條件，對所得方程進行逐步回歸，刪除不顯著項，然后求一階偏導，并令其為0，可得最佳工藝條件為液料比9.86mL/g、提取溫度60.1℃和提取時間51.78min，此時蘆根多糖的最佳得率為9.01%。

圖6 各兩因素交互作用對蘆根多糖得率影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the pairwise effect of three process conditions on extraction rate of polysaccharides from Rhizoma phragmitis

為檢驗Box-Behnken試驗結果的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行蘆根多糖提取驗證實驗，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為液料比9.9∶1、提取溫度60℃、提取時間52min，在此條件下進行3次平行實驗，實際測得的平均蘆根多糖得率9.06%，與預測值基本相符。因此，基于Box-Behnken試驗設計所得的最佳工藝條件準確可靠，具有實用價值。

2.3 抗菌活性

表4 蘆根多糖的抗菌活性Table 4 Antibacterial activity of polysaccharides from Rhizoma phragmitis

抑菌圈試驗判定標準：抑菌圈直徑大于20mm，極敏感；15～20mm，高敏感；10～15mm，中敏感；7～9mm，低敏感；小于7mm，不敏感[14]。由表4可知：超聲輔助提取的蘆根多糖對4種供試菌均有抑制作用，其中對酵母菌屬于極敏感，對金黃色葡萄球菌屬于高敏感，對枯草芽孢桿菌和黑曲霉屬于中敏感。

3 結 論

3.1 由單因素和Box-Behnken試驗設計及其分析結果獲得超聲輔助提取蘆根多糖的最佳工藝條件為液料比9.9∶1、提取溫度60℃、提取時間52min，此時蘆根多糖得率9.06%。

3.2 超聲輔助提取獲得的蘆根多糖(多糖質量濃度15 mg/mL)對酵母菌屬于極敏感，對金黃色葡萄球菌屬于高敏感，對枯草芽孢桿菌和黑曲霉屬于中敏感。

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典∶ 一部[M]. 北京∶ 化學工業(yè)出版社, 2010∶ 152.

[2]耿志華. 蘆根多糖的提取[J]. 基層中藥雜志, 1999, 13(4)∶ 40.

[3]沈蔚, 任曉婷, 張建, 等. 蘆根多糖的提取及其抗氧化活性的研究[J].時珍國醫(yī)國藥, 2010, 21(5)∶ 1078-1080.

[4]江蘇新醫(yī)學院. 中藥大辭典∶ 上冊[M]. 上?！?上?？茖W技術出版社, 2006∶ 1500-1501.

[5]李粉玲, 蔡漢權, 嚴贊開, 等. 酶法提取蘆根多糖的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(4)∶ 156-159.

[6]劉寧, 李健, 金龍哲. 超聲波法提取豆角總皂苷的工藝研究[J]. 食品科學, 2008, 29(10)∶ 327-329.

[7]王晶, 任發(fā)政. 桑樹皮黃酮的超聲波提取及體外抗氧化作用研究[J].食品科學, 2008, 29(4)∶ 206-209.

[8]田甲春, 韓玲, 楊曉麗. 超聲波輔助法提取硫酸軟骨素的工藝研究[J]. 食品科學, 2010, 31(2)∶ 79-81.

[9]CHUA S C, TAN C P, MIRHOSSEINI H, et al. Optimization of ultrasound extraction condition of phospholipids from palm-pressed fiber [J]. Journal of Food Engineering, 2009, 92(4)∶ 403-409.

[10]JALBANI N, KAZI T G, ARAIN B M, et al. Application of factorial design in optimization of ultrasonic-assisted extraction of aluminum in juices and soft drinks[J]. Talanta, 2006, 70(2)∶ 307-314.

[11]CHEMAT S, LAGHA A, AITAMAR H, et al. Comparison of conventional and ultrasound-assisted extraction of carvone and limonene from caraway seeds[J]. Flavour and Fragrance Journal, 2004, 19(3)∶ 188-195.

[12]康波, 班金, 劉志雄. 麥麩多糖的提取工藝研究[J]. 糧食加工, 2009, 34(3)∶ 58-60; 62.

[13]王乃馨, 李超. 杜衡揮發(fā)油的水酶法提取及其抗菌活性研究[J]. 糧油加工, 2010(11)∶ 13-15.

[14]蔡一鳴, 任榮清, 文正常. 中藥方劑的抗菌試驗[J]. 貴州畜牧獸醫(yī), 1995, 19(4)∶ 4-5.

Ultrasound-assisted Extraction and Antibacterial Activity of Polysaccharides from Rhizoma phragmitis

YAO Yi-cai，GENG Zhong-hua，WANG Nai-xin，ZHENG Yi，LI Chao*
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221000, China)

On the basis of single factor experiments, the ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from Rhizoma phragmitis was optimized by response surface methodology. The optimal conditions for polysaccharide extraction were liquid/ material ratio of 9.9∶1 (mL/g), temperature of 60 ℃ and ultrasonic treatment time of 52 min. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of polysaccharides from Rhizoma phragmitis was 9.06%. The extracted polysaccharide sample was extremely sensitive to Saccharmoyces cerevisiae, highly sensitive to Staphy lococcus aureus, and moderately sensitive to Aspergillumniger and Bacillus subtilis. Therefore, polysaccharides from Rhizoma phragmitis can be developed into a novel antibacterial product.

Rhizoma phragmitis；polysaccharides；ultrasound-assisted extraction；antibacterial activity

O623.54

A

1002-6630(2011)14-0147-05

2010-10-08

徐州工程學院青年項目(XKY2010210)；徐州工程學院大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目

姚以才(1988—)，男，本科生，研究方向為功能性食品。E-mail：243525390@qq.com

*通信作者：李超(1978—)，男，講師，博士，研究方向為天然產物化學及食品加工。E-mail：chaoge002@163.com