雙激活劑牛胰酶殼聚糖絮凝法制備工藝優(yōu)化

李君蘭，余群力，張 麗，劉亮亮，郭兆斌

(1.河西學(xué)院綠洲農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 張掖 734000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

雙激活劑牛胰酶殼聚糖絮凝法制備工藝優(yōu)化

李君蘭1,2，余群力2,*，張 麗2，劉亮亮2，郭兆斌2

(1.河西學(xué)院綠洲農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 張掖 734000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

采用Plackett-Burman設(shè)計對影響胰酶活力和提取率的13個因素進(jìn)行篩選，有效篩選出主效因素(P＜0.05)：殼聚糖、CaCl2、胰腺與十二指腸配比和激活pH值。在此基礎(chǔ)上，再運(yùn)用均勻設(shè)計對以上4個顯著因素的最佳水平范圍進(jìn)行研究，通過偏最小二乘法建立回歸方程求解得到胰酶制備最適條件為殼聚糖用量0.17%、CaCl2用量0.06%、胰腺與十二指腸配比8.26∶1、激活pH5.37。此條件下驗(yàn)證實(shí)測值胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶活力和胰酶提取率分別為3408.71U/g、33.11kU/g、23.93kU/g和13.22%，與理論預(yù)測值的相對誤差分別為7.15%、8.56%、10.63%、1.93%。Plackett-Burman設(shè)計和均勻設(shè)計相結(jié)合的方法在雙激活劑胰酶殼聚糖絮凝法制備工藝中具有可行性。

Plackett-Burman設(shè)計；均勻設(shè)計；偏最小二乘法；牛胰酶；殼聚糖；優(yōu)化

中國是畜牧業(yè)生產(chǎn)大國，2006年肉類總產(chǎn)量達(dá)到8.051×107t[1]，屠宰過程產(chǎn)生不可食用的動物胰臟廢棄物約有2.236×105t，其中牛胰腺占20%～30%，對環(huán)境造成極大的污染。胰臟是生化藥品制備的重要資源，它含有多種酶，尤以各種酶蛋白、酶抑制劑及激素物質(zhì)含量很豐富[2-3]，胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶為胰酶的三大主要消化酶，它們在科學(xué)研究、醫(yī)藥、皮革加工、食品工業(yè)及化工等領(lǐng)域都有廣泛的用途[4-5]。我國胰酶的年產(chǎn)量已逾1000t，且一半出口到日、歐、美等國[6]，市場需求量大。據(jù)文獻(xiàn)報道，胰酶制備工藝主要采用醇酮法[3,7-9]，即采用低濃度有機(jī)溶劑提取高濃度有機(jī)溶劑沉淀，其缺陷在于有機(jī)溶劑消耗量大，容易造成環(huán)境污染，生產(chǎn)過程易燃、易爆，產(chǎn)品酶活波動較大，且存在一定劑量的有機(jī)溶劑殘留；超濾法[10]對超濾膜及操作條件要求苛刻；殼聚糖絮凝法[11]的酶活較低。但殼聚糖做胰酶絮凝沉淀劑，不僅沉降效率高、成本低，而且具有抗菌作用[12]，它的用量在0.005%以上時就能抑制金黃色葡萄球菌的生長[13]。

Plackett-Burman[14]設(shè)計法可以通過較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)從眾多的影響因素中篩選出主要的影響因素，目前已廣泛應(yīng)用于生物工藝優(yōu)化研究。而均勻設(shè)計它適用于多因素、多水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計，具有“均勻分散、試驗(yàn)次數(shù)少”等優(yōu)點(diǎn)[15]，對篩選出的主要影響因素進(jìn)行更進(jìn)一步的優(yōu)化，推測出實(shí)驗(yàn)所覆蓋區(qū)域內(nèi)的最優(yōu)操作條件。偏最小二乘法回歸分析(partial least-squares regression，PLS)是一種由數(shù)據(jù)樣本進(jìn)行建模的新型統(tǒng)計回歸方法，集多元線性回歸、主成分分析和典型相關(guān)分析的基本功能為一體，可以較好地解決自變量之間多重相關(guān)性、樣本點(diǎn)容量不宜太少以及多個因變量對多個自變量同時回歸分析等一般回歸分析方法無法解決的問題[16]。本實(shí)驗(yàn)用牛胰臟為原料，Ca2+和十二指腸共同做為胰酶制備激活劑入手，以胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶活力和胰酶提取率為響應(yīng)值，采用Plackett-Burman設(shè)計和均勻設(shè)計相結(jié)合的方法研究胰酶制備工藝。運(yùn)用偏最小二乘回歸分析法對雙激活劑牛胰酶殼聚糖絮凝法制備工藝進(jìn)行考察和評價，并對其主要因素進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得高活力、低有機(jī)溶劑殘留的胰酶制品，為家畜哺乳性動物胰臟的開發(fā)利用提供理論科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛胰臟、膽囊、十二指腸由甘肅臨夏清河源清真食品有限公司提供，樣品從腹腔剝離后立即送入-20℃的冰箱冷凍保存，使用時剔除胰臟周圍的脂肪和結(jié)蹄組織。

CaCl2、CH3COCH3、H3BO3、Na2B4O7、TCA(三氯乙酸)、Na2S2O3等均為AR級；酪氨酸、馬鈴薯淀粉、橄欖油、膽鹽、殼聚糖(脫乙酰度＞92%)、酪蛋白均為生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

D-37520高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；UV-2550型紫外分光光度計 日本島津公司；pHS-酸度計上海精密科學(xué)儀器有限公司；真空冷凍干燥箱 韓國Briton公司。

1.3 方法

1.3.1 胰酶提取工藝流程

胰漿(胰臟與十二指腸混合攪碎)→激活→提取(原料∶乙醇=1∶2)→過濾→胰乳濾液→殼聚糖絮凝→離心(4000r/min，15min，4℃)→脫脂(冷丙酮洗滌)→真空干燥(25℃，真空度600mm Hg)→胰酶粉

1.3.2 胰漿激活方法的比較

胰酶在胰腺中以無活性的酶原形式存在，提取前須激活。胰蛋白酶是一個觸發(fā)酶，能激活胰液中許多其它酶原，且是消化中起關(guān)鍵作用的酶，故以胰蛋白酶活力為響應(yīng)值，通過胰漿中加入CaCl2來探討胰酶被激活的試驗(yàn)。設(shè)置試驗(yàn)方案有：不添加CaCl2直接加乙醇提取胰酶(處理1)；先添加CaCl2胰漿激活后再加乙醇提取(處理2)和先加乙醇提取胰漿后再加CaCl2激活(處理3)，比較3種方法胰漿被激活的效果。激活條件：CaCl2用量0.1%，pH5.5，時間6h，溫度5℃。

1.3.3 激活劑的篩選

選用CaCl2、膽囊、十二指腸做單一激活劑；CaCl2分別與膽囊、十二指腸等量組合構(gòu)成復(fù)合激活劑，以胰蛋白酶活力為響應(yīng)值，觀察單一激活劑與復(fù)合激活劑對胰漿的激活效果。

1.3.4 影響胰酶提取的關(guān)鍵因素篩選

采用Plackett-Burman設(shè)計分別對影響胰酶提取工藝的13個因素進(jìn)行篩選，其中X1～X6為胰酶激活條件、X7～X10為胰酶提取條件、X11～X13為殼聚糖絮凝條件，響應(yīng)值為胰蛋白酶活力和提取率，每個因素的水平范圍取值見表1。實(shí)驗(yàn)設(shè)計和數(shù)據(jù)分析皆采用JMP軟件(Version 7.0.1，SAS Institute Inc.)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 提取工藝優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，對篩選出的4個關(guān)鍵因素：殼聚糖用量(X1，15水平)、CaCl2用量(X2，15水平)、胰腺與十二指腸比例(X3，5水平)、激活pH值(X4，5水平)采用混合均勻試驗(yàn)設(shè)計表U15(152×52)，分析它們對胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活力和提取率的影響。每個因素的取值范圍及水平分別為0.06%≤X1≤0.2%、0.06%≤X2≤0.2%、8∶1≤X3≤12∶1和5≤X4≤6.2。試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)分析及偏最小二乘法回歸方程的建立采用DPS(Version 6.55)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[16-17]。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

1.4.1 胰蛋白酶活力

式中：w1為每1mL酪氨酸對照品溶液中含酪氨酸的量/μg；w為取樣量/g；n為供試品的稀釋倍數(shù)；As為在275nm波長處酪氨酸對照品溶液的吸光度；A為供試品溶液與酪蛋白反應(yīng)后產(chǎn)物在275nm波長的吸光度；A0為空白液在275nm波長處的吸光度。

1.4.2 胰脂肪酶活力

式中：A為樣品消耗NaOH的容積/mL；B為空白消耗NaOH的容積/mL；M為滴定NaOH的濃度/(mol/L)；W、n同上。

1.4.3 胰淀粉酶活力

式中：A為供試品消耗Na2S2O3的容量/mL；B為空白消耗Na2S2O3的容量/mL；F為Na2S2O3滴定液的濃度/(mol/L)的換算值；W、n同上。

1.5 提取率計算

2 結(jié)果與分析

2.1 胰漿激活方法的比較

Development and prospects of fabricated passive house

圖1 激活方法對胰蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of activation methods on trypsin activity

從圖1可看出，3種不同激活方法在0.01水平下對胰蛋白酶活力影響差異顯著，而方法2對胰蛋白酶活力影響最高，與處理1和處理3相比胰蛋白酶活力分別提高了76.02%、 17.32%。所以胰酶激活方式選擇方法2，即先激活后用乙醇提取。

2.2 激活劑篩選與試驗(yàn)效果比較

3種單一激活劑和組合激活劑試驗(yàn)效果如表2所示，3種單一激活劑中CaCl2對胰蛋白酶原的激活效果明顯高于膽囊和十二指腸；而CaCl2-十二指腸組合后對胰漿的激活效果高于CaCl2-苦膽、CaCl2，且在0.01水平下差異都顯著。故選擇CaCl2-十二指腸作為復(fù)合激活劑的優(yōu)化組合。

2.3 影響胰酶提取的關(guān)鍵因素

表2 單一激活劑與復(fù)合激活劑激活胰蛋白酶效果比較Table 2 Comparison of effectiveness of single activators and their combinations in activating trypsin

用JMP軟件對Plackett-Burman設(shè)計的試驗(yàn)結(jié)果(表3)進(jìn)行方差分析，得到影響胰蛋白酶活力和胰酶提取率的各因素效應(yīng)評價結(jié)果見表4。對胰蛋白酶活力和胰酶提取率兩個響應(yīng)指標(biāo)同時有顯著影響的因素有4個(P＜0.05)，胰腺與十二指腸配比X1、激活劑CaCl2用量(X3)、激活pH值(X4)、殼聚糖絮凝劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X11)，因此確定上述4因素為影響胰酶殼聚糖絮凝法制備工藝的關(guān)鍵因素。

2.4 提取工藝的優(yōu)化

2.4.1 均勻設(shè)計與回歸方程的建立

均勻設(shè)計試驗(yàn)方案及其響應(yīng)值見表5。利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件，對本實(shí)驗(yàn)4因素4個響應(yīng)值同時進(jìn)行PLS二次多項(xiàng)式回歸分析，并建立數(shù)學(xué)模型，得到以下4個回歸方程及回歸結(jié)果見表6、7。

使用二次多項(xiàng)式模型為：

式中：β0、βi、βii、βij為回歸系數(shù)，ε為隨機(jī)誤差。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計表及響應(yīng)值Table 3 Plackett-Burman design and corresponding results

表4 各因素的效應(yīng)評價Table 4 Effect evaluation of 13 factors on trypsin activity and extraction rate

表5 均勻設(shè)計U15(152×52)水平編碼及其響應(yīng)值Table 5 Uniform design U15(152× 52) and corresponding experimental results

表6 影響因素對牛胰酶4個響應(yīng)值作用的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)Table 6 Standard regression coefficients of the respective regression equations of trypsin, lipase and amylopsin activities and extraction rate of trypsin

表7 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后模型方程的誤差平方和、決定系數(shù)R2及Press統(tǒng)計量Table 7 Error sum of squares, determination coefficient R2and predicted residual sum of squares of the respective regression equations of trypsin, lipase and amylopsin activities and extraction rate of trypsin after data normalization

從表6的回歸系數(shù)可以看出，4個影響因素對胰酶活力和提取率主效應(yīng)值的影響。CaCl2與十二指腸對胰蛋白酶、胰淀粉酶主效應(yīng)的影響呈正效應(yīng)，說明兩種激活劑是提高胰蛋白酶、胰淀粉酶活力的主要添加成分，CaCl2對胰蛋白酶活力的影響大于十二指腸，是胰蛋白酶原有效的激活劑，文獻(xiàn)[8]和[19]中也有證明，同時CaCl2對胰淀粉酶也有激活作用，文獻(xiàn)[20]中已有證明，本實(shí)驗(yàn)也證明了以上兩點(diǎn)。CaCl2對胰脂肪酶的活力和胰酶提取率的影響呈負(fù)效應(yīng)；胰腺與十二指腸配比對三酶活力的影響均呈正效應(yīng)，說明十二指腸有增加胰酶活力的作用，特別是對胰淀粉酶活力的影響最大；因?yàn)槭改c黏膜和腸液中含有腸激酶(enterokinase)，天然腸激酶由1條結(jié)構(gòu)亞基(重鏈)和1條催化弧基(輕鏈)構(gòu)成，兩者通過1個分子間二硫鍵結(jié)合，結(jié)構(gòu)亞基負(fù)責(zé)將催化亞基固定在小腸刷狀緣膜上并引導(dǎo)它向腸腔移動，催化亞基可以特異性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，將胰蛋白酶原活化為胰蛋白酶，從而啟動各種酶原活化的級聯(lián)[21]。所以它對胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶活力都有提高的作用。但對胰酶提取率呈負(fù)效應(yīng)；殼聚糖對胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的影響呈負(fù)效應(yīng)；對胰酶提取率指標(biāo)呈正效應(yīng)；即殼聚糖用量越小，越有利于胰酶活力的提高。其原因?yàn)闅ぞ厶切跄两狄让笗r，可能通過交聯(lián)作用與酶蛋白結(jié)合，它的用量越大，這種交聯(lián)作用就越強(qiáng)，與殼聚糖交聯(lián)的酶蛋白也就越多，由于這種交聯(lián)作用，酶蛋白被束縛在殼聚糖周圍，形成了一定的空間位阻，使酶反應(yīng)受擴(kuò)散限制的影響，酶分子與底物更難以結(jié)合，同時殼聚糖與酶蛋白結(jié)合也會造成酶分子空間結(jié)構(gòu)和活性中心空間構(gòu)想的改變，從而導(dǎo)致比酶活的下降。激活pH值對胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的指標(biāo)影響呈正效應(yīng)，對胰酶提取率影響呈負(fù)效應(yīng)。

另外，交互項(xiàng)回歸系數(shù)可以反映因素間交互作用對胰酶活力的影響。例如，X3X4的交互對3種酶活力的影響呈正效應(yīng)，同時它對胰脂肪酶、胰蛋白酶影響也較大；X2X4、X1X4的交互項(xiàng)回歸系數(shù)分別對胰蛋白酶、胰酶提取率的影響最大。說明因素間的交互作用利于提高胰酶活力和提取率。

從表7可看出，4個方程的誤差平方和、決定系數(shù)R2、預(yù)測參差平方3個統(tǒng)計量的變化，當(dāng)潛變量個數(shù)為4時，每個回歸方程的誤差平方和、預(yù)測參差平方逐漸減小，而決定系數(shù)R2逐漸增大，分別為Y1=0.9276、Y2= 0.9412、Y3=0.9660、Y4=0.9661，說明4個二次多項(xiàng)式回歸方程模型的擬合結(jié)果良好，具有統(tǒng)計學(xué)意義。因而，可以選取方程Y1、Y2、Y3、Y4分別為胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶活力和胰酶提取率優(yōu)化所用方程。

2.4.2 胰酶提取最優(yōu)工藝條件確定

利用上述建立的回歸方程，通過DPS軟件處理得出最優(yōu)制備工藝參數(shù)為殼聚糖用量0.17%、CaCl2用量0.06%、胰腺與十二指腸配比8.26∶1、激活pH5.37。各響應(yīng)指標(biāo)的理論預(yù)測值分別為胰蛋白酶活力3181.35U/g、胰脂肪酶活力30.50kU/g、胰淀粉酶活力21.63kU/g、胰酶提取率12.97%。其他各因素取值不變進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其結(jié)果見表8，驗(yàn)證實(shí)測值與理論預(yù)測值的相對誤差胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的活力和胰酶提取率分別是為7.15%、8.56%、10.63%、1.93%。進(jìn)一步驗(yàn)證了數(shù)學(xué)二次多項(xiàng)式回歸模型的適合性，PLS優(yōu)化結(jié)果的合理性。

文獻(xiàn)[18]規(guī)定胰酶活力用胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的比活力做為評價指標(biāo)(3種酶的最低酶限量指標(biāo)為蛋白酶600U/g、脂肪酶4000U/g、淀粉酶7000U/g)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶三酶活力比國家藥典規(guī)定的活力分別提高了5.68、8.28、3.42倍。牛胰酶粉的感官性狀為淡黃色粉末，具有特殊的肉臭味和吸濕性，符合藥典規(guī)定。

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of validation experiments under optimal preparation conditions

3 結(jié) 論

通過plackett-Burman對影響胰酶制備的13個因素進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計和數(shù)據(jù)方差分析，得到對胰蛋白酶活力和胰酶提取率共同有顯著影響(P＜0.05)的4個因素，再經(jīng)過4因素的混合均勻試驗(yàn)，結(jié)合PLS回歸原理統(tǒng)計分析，獲得牛胰酶制備最適條件為殼聚糖用量0.17%、CaCl2用量0.06%、胰腺與十二指腸配比為8.26∶1、激活pH5.37。此條件下驗(yàn)證實(shí)測值胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的活力分別為3408.71U/g、33.11kU/g、23.93kU/g，胰酶提取率達(dá)到了13.22%，與理論預(yù)測值的相對誤差分別為7.15%、8.56%、10.63%、1.93%。產(chǎn)品感官指標(biāo)、理化指標(biāo)符合國家藥典規(guī)定。

[1]楊華, 劉玉花, 馬儷珍, 等. 羊骨蛋白酶解物免疫活性及酶解條件的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(10)∶ 3214-3221.

[2]BERDUTINA A V, NEKLYUDOV A D, IVANKIN A I, et al. Comparison of proteolytic activities of the enzyme complex from mammalian pancreas and pancreatin[J]. Applied Biochemistry and Microbiology, 2000, 36(4)∶ 363-367.

[3]SCHULTZE Hans, Isolation of pancreatin∶ US, 4623624[P]. 1986-11-18.

[4]KLOMKLAO S, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W. Comparative studies on proteolytic activity of spleen extract from three tuna species commonly used in Thailand[J]. Journal of Food Biochemistry, 2004, 28 (5)∶ 355-372.

[5]KLOMKLAO S, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Partitioning and recovery of proteinase from tuna spleen by aqueous twophase systems[J]. Process. Biochemistry, 2005, 40(9)∶ 3061-3067.

[6]鐘曉勤, 赫毅, 何澤超. 胰酶中鎘的去除研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2008, 20(1)∶ 117-120.

[7]范秀娟, 張達(dá)磊, 李桂生. 溫度及不同濃度乙醇對胰酶活力的影響[J]. 中國生化藥物雜志, 2001, 22(2)∶ 95-96.

[8]吳曉英, 張聚寶, 林影, 等. 胰酶制備新工藝研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報, 2005, 21(1)∶ 64-67.

[9]趙小蘭. 胰酶制備工藝研究[J]. 青海醫(yī)藥雜志, 2000, 30(4)∶ 56-57.

[10]ABBOUDI E I, BEAULIEU M, BELLAVANCE F. Method for producing pancreatin which contains low amounts of residual organic solvent and product thereof∶ US, 5861291[P]. 1999-02-24.

[11]唐愛星, 何澤超, 郭麗. 絮凝法生產(chǎn)胰酶[J]. 中國生化藥物雜志, 2005, 26(3)∶ 166-168.

[12]KNORR D. Nutritioal quality. Food processing and biotechnology aspect of chitin and chitosan[J]. Process Biochemistry, 1986, 21(3)∶ 90-92.

[13]DARMADJI P, IZUMIMOTO M. Effect of chitosan in meat preservation [J]. Meat Science, 1994, 38(2)∶ 243-254.

[14]PLACKETT R L, BURMAN J P. The design of optimum multifactorial experiments[J]. Biometrika, 1946, 33(4)∶ 305-325.

[15]方開泰. 均勻設(shè)計與均勻設(shè)計表[M]. 北京∶ 科學(xué)出版社, 1994∶ 14.

[16]唐啟義, 唐潔. 偏最小二乘回歸分析在均勻設(shè)計試驗(yàn)建模分析中的應(yīng)用[J]. 數(shù)理統(tǒng)計與管理, 2005, 25(5)∶ 45-51.

[17]唐啟義, 馮明光. 實(shí)用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M]. 北京∶科學(xué)出版社, 2002∶ 597-602.

[18]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典∶ 二部[M]. 北京∶ 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005∶ 631-633.

[19]KLOMKLAO S, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. 29kDa Trypsin from the pyloric ceca of Atlantic Bonito (Sarda sarda)∶ recovery and characterization[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55(11)∶ 4548-4553.

[20]畢金峰. 兩種淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2005, 21(增刊2)∶ 238-241.

[21]張向輝, 譚樹華, 李泰民. 腸激酶特點(diǎn)及其基因工程的研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù), 2005, 12(5)∶ 347-350.

Process Optimization for Preparation of Bovine Trypsin by Dual-factor Activation and Subsequent Chitosan Flocculation

LI Jun-lan1,2，YU Qun-li2,*，ZHANG Li2，LIU Liang-liang2，GUO Zhao-bin2
(1. Oasis Agricultural Research Institute, Hexi University, Zhangye 734000, China；2. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

With the aim of developing a method to prepare bovine trypsin by dual-factor activation and subsequent chitosan flocculation, Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of 13 process conditions on the activity and extraction rate of trypsin to screen out 4 most significant ones (P＜0.05) including chtosan amount, ratio of bovine pancreas to duodenum and activation pH. Their optimal levels were optimized by the combined use of uniform design and partial least squares regression as follows∶ chtosan amount of 0.17%, CaCl2 amount of 0.06%, pancreas-duodenum ratio of 8.26∶1, and activation pH 5.37, respectively. Under the optimized conditions, the activities of trypsin, lipase and amylopsin and the extraction rate of trypsin were observed to be 3408.71 U/g, 33.11 kU/g, 23.93 kU/g and 13.22%, respectively, which exhibited a relative error of 7.15%, 8.56%, 10.63% and 1.93% when compared with their predicted counterparts. Therefore, the combined use of Plackett-Burman design and uniform design is feasible to optimize the preparation of trypsin by dual-factor activation and subsequent chitosan flocculation.

Plackett-Burman design；uniform design；partial least squares regression；bovine pancreatin；chitosan；optimization

Q814.4

A

1002-6630(2011)14-0090-06

2010-08-26

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究開發(fā)項(xiàng)目(GNSW-2007-06)

李君蘭(1966—)，女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)閯游锸称窢I養(yǎng)與工程。E-mail：qwzhaohui@126.com

*通信作者：余群力(1961—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)閯游锸称窢I養(yǎng)與工程。E-mail：yuqunli@gsau.edu.cn