職業(yè)電磁輻射環(huán)境對大鼠小腦普肯耶細胞G luR2定位表達的影響

劉 勇 黃尉初 周 文 劉大星 王修德

研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是電磁輻射最為敏感的靶器官，急性電磁輻射能夠損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習記憶功能［1，2］。隨著環(huán)境電磁輻射污染日益嚴重，探討低劑量電磁輻射對職業(yè)接觸者和普通人群的影響特點和規(guī)律，具有十分重要的現(xiàn)實意義。中樞神經(jīng)系統(tǒng)有多種學(xué)習記憶類型，除了海馬腦區(qū)具有學(xué)習記憶功能外，小腦已被證實是運動性學(xué)習記憶的主要功能腦區(qū)［3］。突觸長時程抑制(long term depression， LTD)是小腦運動性學(xué)習記憶功能的神經(jīng)電生理基礎(chǔ)［4］，小腦 LTD的形成和保持受普肯耶細胞膜上AMPA(α－amino－3－h(huán)ydroxy－5－methyl－4－isoxazolepropionic acid)受體的調(diào)控，其中谷氨酸受體2(glutamate receptor 2，GluR2)及其磷酸化形式在LTD過程中起核心作用［5，6］。本研究模擬電磁輻射的短期職業(yè)接觸環(huán)境，觀察電磁輻射后小腦普肯耶細胞上GluR2及其磷酸化蛋白質(zhì)定位表達水平的變化，探討低劑量電磁輻射對大鼠小腦運動性學(xué)習記憶功能的影響特點和規(guī)律。

材料與方法

1.實驗儀器和試劑:PM20顯微數(shù)碼照相系統(tǒng)(Olympus，Japan);羊抗鼠GluR2多克隆抗體(Santa Crus，USA);羊抗鼠磷酸化GluR2(Ser880/831)多克隆抗體(Santa Crus，USA);辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊二抗(北京中杉);濃縮型DAB試劑盒(北京中杉);多聚賴氨酸(Sigma，USA);過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒(北京中杉)。

2.實驗動物及分組:健康雄性Wistar大鼠60只，體重180～220g，隨機分為假性輻射組(0mW/cm2，30min/d，7天)和電磁波輻射組(5mW/cm2，30min/d，7天)，輻射組又設(shè)定輻射后0、3、12、24、72h等5個時相點，每組10只大鼠。

3.電磁輻射處理:每天將輻射組大鼠置于反射系數(shù)近似為零的微波暗室內(nèi)，在旋轉(zhuǎn)平臺上以平均功率密度為5mW/ cm2的S波段電磁波進行全身均勻輻射30min，連續(xù)7天，模擬職業(yè)電磁輻射暴露環(huán)境;假輻射組大鼠在相同條件下，每天以0mW/cm2的電磁波進行處理。暗室環(huán)境溫度穩(wěn)定于20 ±2℃，相對濕度穩(wěn)定于(60±10)%。

4.GluR2的定位表達檢測:采用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠小腦普肯耶細胞上GluR2及其磷酸化蛋白質(zhì)的定位表達水平。具體方法是:在相應(yīng)時相點取大鼠小腦組織，4%多聚甲醛液固定，制成石蠟切片，切片脫蠟至水后，按SP法進行免疫組化標記(實驗步驟參照試劑盒使用說明書進行)，DAB試劑盒顯色，蒸餾水充分沖洗，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用PM 20顯微數(shù)碼照相系統(tǒng)采集圖片，每個時相點、每個切片隨機采集5～8個視野(即5～8幅測試圖像)，用Image－Pro Plus(Media Cybernetics Inc.USA)圖像分析系統(tǒng)測算其中3幅染色效果一致的圖像的平均光密度值，進行定量分析。

5.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差±s)表示，應(yīng)用方差齊性檢驗和t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.電磁輻射對大鼠小腦普肯耶細胞上GluR2蛋白質(zhì)定位表達的影響:實驗結(jié)果顯示，與假性輻射組相比，電磁輻射后0、3、12、24、72h等各時相組大鼠小腦普肯耶細胞上GluR2蛋白質(zhì)均正常表達于胞膜和胞質(zhì)中，且表達量沒有顯著變化(圖1、圖2)。

2.電磁輻射對大鼠小腦普肯耶細胞上磷酸化GluR2蛋白質(zhì)定位表達的影響:實驗結(jié)果顯示，與假性輻射組相比，電磁輻射后0、3、12、24、72h等各時相組大鼠小腦普肯耶細胞上磷酸化GluR2蛋白質(zhì)均正常表達于胞膜和胞質(zhì)中，且表達量沒有顯著變化(圖3、圖4)。

討論

神經(jīng)科學(xué)研究表明，小腦不僅是維持機體平衡的重要器官，也是運動性學(xué)習記憶的主要功能腦區(qū)［7］。普肯耶細胞是小腦皮質(zhì)唯一的傳出性神經(jīng)元，在小腦學(xué)習記憶過程中起核心作用［8］。突觸長時程抑制(LTD)是小腦運動性學(xué)習記憶功能的神經(jīng)電生理學(xué)基礎(chǔ)，普肯耶細胞突觸后膜上的GluR2是LTD形成過程中最為關(guān)鍵的蛋白質(zhì)分子［9，10］。GluR2通過自身的磷酸化改變，將神經(jīng)信號從突觸前膜傳遞到突觸后膜，并最終形成學(xué)習記憶［11］。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為電磁輻射最為敏感的靶器官，其學(xué)習記憶功能障礙是最典型的損傷效應(yīng)。大量研究證實，急性電磁輻射可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習記憶功能損傷。而日益嚴重的環(huán)境電磁污染也時刻威脅著人們的健康。目前在電磁輻射領(lǐng)域?qū)W(xué)習記憶損傷的研究主要集中在海馬腦區(qū)，而電磁輻射致小腦運動性學(xué)習記憶功能損傷的特點及其相關(guān)機制，卻鮮見有文獻報道。因此，探討二者之間的關(guān)系具有非常重要的意義。

本實驗?zāi)M短期低劑量的電磁輻射環(huán)境，探討該輻射環(huán)境對小腦普肯耶細胞GluR2及其磷酸化蛋白質(zhì)定位表達的影響。實驗結(jié)果顯示，大鼠每天給予5mW/cm2的電磁波全身均勻輻射30min，連續(xù)7天，大鼠小腦普肯耶細胞GluR2及其磷酸化蛋白質(zhì)的定位表達水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化。由于GluR2的磷酸化改變在與小腦運動性學(xué)習記憶功能直接相關(guān)的突觸長時程抑制過程中起核心作用，而在本實驗?zāi)M的短期低劑量電磁輻射環(huán)境下GluR2的磷酸化水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化，因此我們推測，短期接觸低劑量的電磁輻射可能不會損害小腦的學(xué)習記憶功能。這一推測有待于進一步的研究證實。

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