A型流感病毒跨種傳播和致病性相關(guān)蛋白研究進展＊

于志君，朱曉文，劉 紅，李 碩，范寶靜，王世申，吳 靜，武艷麗，王鐵成，楊松濤，黃 耕，高玉偉，夏咸柱＊

（1.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，吉林 長春 130062；2.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人畜共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122；3.長春市疾病預防控制中心，吉林 長春 130033）

A型流感病毒（Influenza A virus）在我國亦稱甲型流感病毒，屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），是單股負鏈RNA病毒[1]。該病毒的基因組由8條分節(jié)段的RNA片段組成，共編碼11種蛋白[1]。根據(jù)病毒血凝素（haemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性的不同，A型流感病毒被分為16種HA亞型和9種NA亞型[1]。雁形目（Anseriformes）和鸻形目（Charadriformes，如海鷗和岸禽）的水禽是A型流感病毒的自然宿主[2－3]，目前已知的A型流感病毒所有亞型均能從鳥類體內(nèi)分離出來[3]。

歷史上共發(fā)生過4次流感大流行，分別是1918年的西班牙流感、1957年的亞洲流感、1968年的香港流感和2009年的甲型H1N1流感。2009年甲型H1N1流感疫情的暴發(fā)改變了人們之前對流感大流行的認識，以往人們普遍認為下一次流感大流行一定是由一種新的亞型流感病毒引起。迄今為止，包括2009年甲型H1N1流感大流行在內(nèi)的所有流感大流行均是由A型流感病毒引起，因此研究A型流感病毒致病性機制可以為人們制定流感病毒防控和治療策略提供參考。另外，自從1997年香港首次報道人類感染H5N1亞型高致病性禽流感病毒后，動物流感病毒跨越種屬障礙感染人的事件便時有發(fā)生，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴重威脅，引起人們對A型流感病毒跨種傳播的關(guān)注。目前研究發(fā)現(xiàn)，A型流感病毒的跨種傳播和致病性主要受聚合酶蛋白、血凝素蛋白影響，因此本文將討論的焦點主要集中在以上兩種蛋白上，另外非結(jié)構(gòu)蛋白1和PB1－F2蛋白對流感病毒的致病性也有一定的影響。

1 聚合酶蛋白

1.1 對流感病毒跨種傳播的影響

1.1.1 調(diào)控病毒的溫度敏感性 若流感病毒PB2蛋白第627位氨基酸為賴氨酸（K），則該毒株可以在哺乳動物上呼吸道內(nèi)有效復制，若PB2蛋白第627位氨基酸為谷氨酸（E），則該毒株不能在哺乳動物上呼吸道內(nèi)有效復制[4]。體外試驗證明，PB2－E627K突變在溫度為33℃時可以增強病毒在哺乳動物細胞上的復制能力，但37℃和41℃時則不能[5]。從這些試驗結(jié)果來看，流感病毒可以通過聚合酶蛋白上氨基酸突變來改變毒株的溫度敏感性，調(diào)控A型流感病毒的跨種傳播。

1.1.2 調(diào)控入核轉(zhuǎn)運 研究人員采用基因沉默技術(shù)發(fā)現(xiàn)入核轉(zhuǎn)運蛋白α與流感病毒的復制有關(guān)[6－8]。入核轉(zhuǎn)運蛋白α主要與流感病毒的聚合酶蛋白進行結(jié)合，介導該類蛋白的入核轉(zhuǎn)運過程。研究者在研究一株名為SC35M的流感病毒鼠適應株時發(fā)現(xiàn)，該病毒的PB2－D701N突變和NP－N319K突變可以顯著增強病毒蛋白與哺乳動物細胞的入核轉(zhuǎn)運蛋白α1之間的結(jié)合能力。另外，有研究表明PB2－D701N突變也可以通過促進PB2聚合酶蛋白上核定位信號的暴露來增加病毒PB2蛋白與入核轉(zhuǎn)運蛋白α之間的結(jié)合[9]。研究表明，流感病毒聚合酶蛋白對入核轉(zhuǎn)運過程的適應可能在流感病毒跨種傳播過程中扮演了重要的角色[10]。

1.2 對流感病毒致病性的影響

流感病毒聚合酶蛋白可以通過直接影響病毒的復制效率來改變病毒的致病性。研究者在研究一株名為SC35的H7N7亞型高致病性禽流感病毒時發(fā)現(xiàn)，該病毒對小鼠致病力的強弱受病毒PB2蛋白調(diào)控[11]。研究者將SC35適應小鼠后得到SC35鼠適應株（SC35M），測序和序列比對后發(fā)現(xiàn)，SC35M病毒蛋白上的多個氨基酸位點發(fā)生置換，為了鑒定出與病毒致病性增強有關(guān)的氨基酸置換，研究者采用反向遺傳技術(shù)拯救出具有不同氨基酸置換位點的SC35流感病毒并對其生物學特性進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SC35母本毒株相比，發(fā)生PB2－D701N、PB2－S714R和PA－K615N氨基酸置換的流感病毒在哺乳動物細胞上的復制效率顯著提高，而在禽類細胞上的復制效率則顯著下降，并且具有上述氨基酸置換的流感病毒對小鼠的致病性也顯著增強，因此，研究者認為，該病毒的聚合酶蛋白通過影響病毒的復制效率來改變病毒的致病性。流感病毒PB2－D701N突變還會影響病毒的傳播性。研究者在研究一株名為DKGX／35的H5N1亞型禽流感病毒時發(fā)現(xiàn)該毒株P(guān)B2蛋白第701位氨基酸為谷氨酰胺（N）是該病毒能夠在豚鼠間進行有效傳播的前提條件[12]。除了PB2－D701N 突變外，PB2－E627K突變也與流感病毒的致病性密切相關(guān)[13－14]。通常情況下，禽流感病毒PB2蛋白第627位為谷氨酸（E），而人流感病毒為賴氨酸（K）。研究證實，H5N1亞型禽流感病毒PB2蛋白上第627位氨基酸若為谷氨酸（E），則該毒株對哺乳動物無致病性，但如果該位點為賴氨酸，則毒株接種小鼠后可以引起小鼠全身性感染并導致小鼠發(fā)病死亡[13]。研究者發(fā)現(xiàn)禽流感病毒在小鼠身上傳一代即可獲得PB2－E627K突變[4，15]，而一些從人類感染者體內(nèi)分離出的 H5N1亞型禽流感病毒也具備 PB2－E627K 突變[16－17]，這些發(fā)現(xiàn)都表明PB2－E627K突變與流感病毒致病力的改變密切相關(guān)。另外，流感病毒PB2－E627K突變也會影響病毒的傳播性[18]。

測序發(fā)現(xiàn)甲型H1N1流感病毒PB2蛋白第627位和第701位氨基酸殘基都為“禽型”氨基酸（PB2－701D，PB2－627E）[19]，為了證明這是否是導致該病毒對人致病性較弱的原因，研究者通過反向遺傳技術(shù)在這兩個位點上引入PB2－E627K突變和PB2－D701N突變，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變后的流感病毒對小鼠和雪貂的致病性均未增強[20]，說明這兩個氨基酸位點不能影響甲流病毒對哺乳動物的致病性。近來經(jīng)證實，PA－E298K突變可以顯著增強甲型H1N1流感病毒對小鼠的致病力[21]，不過該氨基酸位點是否是甲型H1N1流感病毒惟一的毒力決定子尚有待進一步研究。

2 血凝素

2.1 對流感病毒跨種傳播的影響

由于不同宿主細胞表面的受體類型存在差異，因此某種流感病毒能夠感染的宿主范圍受病毒血凝素受體結(jié)合特異性調(diào)控[22]。人流感病毒具有α2，6交聯(lián)唾液酸受體結(jié)合特異性（又稱“人型”受體結(jié)合特異性），因此易感染分布有α2，6交聯(lián)唾液酸受體的人呼吸道上皮細胞，而禽流感病則具有α2，3交聯(lián)唾液酸受體結(jié)合特異性（又稱“禽型”受體結(jié)合特異性），因此易感染分布有α2，3交聯(lián)唾液酸受體的禽腸道上皮細胞[23－25]。對于不同亞型流感病毒而言，其血凝素蛋白上調(diào)控受體結(jié)合特異性的氨基酸位點并不相同。對H1亞型流感病毒而言，若其血凝素第190位（文中出現(xiàn)的血凝素上氨基酸位點的位置均相對于H3亞型流感病毒而言）和第225位氨基酸殘基為天冬氨酸（D），則該毒株具有“人型”受體結(jié)合特異性，若其血凝素第190位氨基酸殘基為谷氨酸（E）、第225位氨基酸殘基為甘氨酸（G），則該毒株具有“禽型”受體結(jié)合特異性；對H2、H3亞型流感病毒而言，若其血凝素第226位氨基酸殘基為亮氨酸（L）、第228位氨基酸殘基為絲氨酸（S），則該毒株具有“人型”受體結(jié)合特異性；若其血凝素第226位氨基酸殘基為谷氨酰胺（N）、第228位氨基酸殘基為甘氨酸（G），則該毒株具有“禽型”受體結(jié)合特異性[26]。

目前，科學家們已經(jīng)采用糖芯片（carbohydrate microarrays）技術(shù)研究了甲型H1N1流感病毒的受體特異性。其中一項研究結(jié)果顯示該病毒只能夠與α2－6交聯(lián)唾液酸序列結(jié)合[27]，然而另外一項采用了其他糖芯片進行研究的試驗結(jié)果則顯示該病毒也能夠與包含α2－3交聯(lián)唾液酸序列的探針結(jié)合，但仍以α2－6交聯(lián)唾液酸受體特異性為主。因此，流感病毒大流行株對血凝素受體結(jié)合特異性的要求并沒有大的改變，即流感病毒仍然需要具有“人型”受體結(jié)合特異性才能在人群中引發(fā)流感疫情。

近年來，H5N1亞型流感病毒跨種傳播感染人的事件頻頻發(fā)生，死亡率接近60%。但從這些患者體內(nèi)分離出的H5N1亞型流感病毒的受體結(jié)合特性沒有發(fā)生任何改變，即仍偏向于結(jié)合α2，3受體（“禽”型受體）[13]。另外，盡管 H5N1亞型流感病毒的致死率較高，但該亞型病毒并不能在感染者與接觸者之間進行有效傳播，以上兩點再一次證明流感病毒需要具有“人型”受體結(jié)合特異性才能在人群中進行有效地傳播。

2.2 對流感病毒致病性的影響

血凝素蛋白水解酶活性是流感病毒的一個主要毒力決定子。因為只有血凝素前體H0被宿主體內(nèi)存在的蛋白水解酶裂解為HA1和HA2而暴露出HA2氨基端的融合肽后，病毒囊膜才能與宿主細胞膜進行融合，感染宿主細胞。高致病性禽流感病毒（HPAIV）對禽類的高致病性與其血凝素前體H0的高蛋白水解酶活性密切相關(guān)[28]。對于低致病性禽流感病毒（LPAIV），其血凝素裂解位點處只有一個精氨酸（R），只能被宿主類胰蛋白酶裂解，而這類酶只分布在少數(shù)幾個臟器中，故限制了病毒對組織臟器的感染；而高致病性禽流感病毒則不同，它們的血凝素前體H0的裂解位點處為多個堿性氨基酸，可以被多種酶類（如弗林蛋白酶和PC6蛋白酶）裂解。不過目前人們只在高致病性禽流感病毒中發(fā)現(xiàn)多堿性裂解位點，尚沒有從人群中分離出血凝素上帶有多堿性裂解位點的人流感病毒。

3 非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）對流感病毒致病性的影響

A型流感病毒的致病性與其逃避機體免疫應答的能力密切相關(guān)，而非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）在病毒逃避機體免疫的過程中起著重要的作用。NS1蛋白最重要的功能是頡頏干擾素（IFN）。NS1蛋白主要通過兩種途徑來發(fā)揮干擾素頡頏劑功能以消除機體對流感病毒的免疫應答：①通過NS1蛋白與雙鏈RNA的結(jié)合來抑制I型干擾素激活物——雙鏈RNA激活蛋白激酶（double－stranded RNA－activated protein kinase）的活化；②NS1蛋白可以通過阻止流感病毒的病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）識別類維生素A誘導基因1（retinoid inducible gene－1，RIG－1）等途徑，抑制刺激干擾素合成的轉(zhuǎn)錄因子的活化。

NS1蛋白上的某些氨基酸殘基與流感病毒的毒力密切相關(guān)。如果H5N1亞型高致病性禽流感病毒NS1蛋白第92位氨基酸是谷氨酸（E），則該毒株對小鼠有致病性，如果是天冬氨酸（D），則對小鼠無致病性。體外試驗證明，如果NS1蛋白第92位氨基酸是谷氨酸（E），則該毒株可以在存在干擾素的細胞上復制，并且對豬有致病性。同樣，當一株H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白上發(fā)生NS1－P42S突變后，該毒株對小鼠的毒力顯著增強，并且在體外試驗中該突變株可以減少α干擾素和β干擾素的產(chǎn)量。在體外試驗中發(fā)現(xiàn)，H5N1亞型禽流感病毒的NS1蛋白上若發(fā)生NS1－L103F 和 NS1－I106M突變，則NS1蛋白與細胞前體mRNA加工處理蛋白－切割及多聚腺苷酸化特異性因子30（cleavage and polyadenylation specificity factor 30，CPSF30）的結(jié)合能力增強，同時病毒的復制能力也顯著增強，研究者由此推斷流感病毒能夠通過NS1蛋白來抑制α干擾素和β干擾素前體mRNA的表達，從而提高病毒在宿主體內(nèi)的復制能力。

有研究顯示，盡管甲型H1N1亞型流感病毒能夠抑制干擾素的表達，但是該病毒的NS1蛋白卻不能與CPSF30結(jié)合[29]。然而，將甲型H1N1亞型流感病毒NS1蛋白108、125和189三處位點上的氨基酸突變成其他人流感病毒在相同位點處所共有的保守氨基酸后，變異株對小鼠和雪貂的毒力減弱，表明該病毒的NS1蛋白可以調(diào)控其毒力，因此研究NS1蛋白的生物學活性可能有助于我們探究A型流感病毒致病性的分子機制。

另外，NS1蛋白的羧基端也會影響流感病毒的致病性，但具體機制尚待研究。1918年西班牙流感病毒和H5N1亞型高致病性禽流感病毒的羧基端都有一段由4個羧基端氨基酸組成PDZ配體區(qū)，當把這個PDZ配體區(qū)引入到鼠適應性流感毒株后，可以增強鼠適應株對小鼠的毒力。雖然我們尚不知道NS1蛋白PDZ配體區(qū)的致病機制，但是這個PDZ配體區(qū)應該與NS1蛋白的抗干擾素作用無關(guān)。

4 PB1－F2蛋白對流感病毒致病性的影響

PB1－F2蛋白是由PB1基因＋1讀碼框編碼的小蛋白，共有90個氨基酸。PB1－F2蛋白具有調(diào)控流感病毒感染早期的病毒毒力和誘導繼發(fā)性細菌感染的功能。PB1－F2蛋白能夠和線粒體的電依賴陰離子通道1（VDAC－1）及腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白3（ANT3）相互作用，破壞細胞線粒體，促進免疫細胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，當1918年西班牙流感病毒和H5N1亞型高致病性禽流感病毒PB1－F2蛋白上發(fā)生PB1－F2－S66N突變后，這兩株毒株對小鼠的毒力減弱，而當發(fā)生N66S突變時，病毒對小鼠的致病性則顯著增強。甲型H1N1流感病毒的PB1－F2蛋白由11個氨基酸組成，缺失了一段氨基酸。而且不論是引入 PB1－F2－66N 還是 PB1－F2－66S，甲型 H1N1亞型流感病毒對小鼠及雪貂的毒力都沒有明顯增強，也不會使小鼠更易出現(xiàn)由肺炎鏈球菌介導的繼發(fā)性細菌感染[30]。

5 小結(jié)

A型流感病毒每年都在發(fā)生變異，對公共安全構(gòu)成嚴重危害，因此，研究A型流感病毒跨種傳播和致病性的分子機制可以為防控流感疫情提供理論基礎(chǔ)。目前的研究發(fā)現(xiàn)該型病毒的跨種傳播和致病性主要受病毒的聚合酶蛋白、血凝素蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白影響，但病毒的其他蛋白是否也對病毒有影響還在進一步的研究中。另外，雖然目前甲型流感疫情已經(jīng)過去，但有證據(jù)表明甲型H1N1亞型流感病毒的聚合酶蛋白和NS1蛋白并沒有充分適應人類宿主，這表明該病毒的流行性和潛在致病性可能還沒有被完全耗盡，而且根據(jù)以往流感病毒的流行規(guī)律，甲型H1N1流感病毒還會在人群中循環(huán)相當長一段時間，不能排除該病毒通過長時間抗原漂移或基因重組而產(chǎn)生毒力和傳播性更強的變異株的可能，因此應繼續(xù)對已出現(xiàn)的流感毒株進行分析，并深入研究影響A型流感病毒跨種傳播和致病性的病毒蛋白，為預測具有潛在流行性的毒株奠定基礎(chǔ)。

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