輻照對(duì)透明質(zhì)酸理化特性的影響

鄒朝暉，王 強(qiáng)，王志東，鄧鋼橋，李淑榮,*，高美須，陳永浩，范 蓓，李慶鵬，趙宏偉

輻照對(duì)透明質(zhì)酸理化特性的影響

鄒朝暉1,2，王 強(qiáng)1，王志東1，鄧鋼橋2，李淑榮1,*，高美須1，陳永浩1，范 蓓1，李慶鵬1，趙宏偉1

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

采用60Co-γ射線對(duì)0.5g/100mL透明質(zhì)酸氯化鈉溶液進(jìn)行輻照處理，通過溶液的pH值、黏度值、色度和紅外光譜及紫外光譜等變化研究輻照對(duì)透明質(zhì)酸理化特性的影響。結(jié)果表明：輻照降低透明質(zhì)酸的分子質(zhì)量、pH值、特性黏度，溶液的顏色比未輻照的更黃。通過紫外和紅外掃描觀察，透明質(zhì)酸在輻照前后的吸收特征峰沒有太大的變化，吸收強(qiáng)度發(fā)生變化。輻照后透明質(zhì)酸對(duì)DPPH自由基的清除作用隨著輻照劑量的增大逐漸增強(qiáng)。

透明質(zhì)酸；輻照；降解；理化特性

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是一種由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,3和β-1,4糖苷鍵反復(fù)交替連接而成的鏈狀高分子黏多糖，是一種線性大分子黏多糖[1-3]。HA是構(gòu)成細(xì)胞間基質(zhì)和胞外基質(zhì)的主要成分，以關(guān)節(jié)腔、血管、心臟和皮膚等組織中的含量較高[4]，這種高分子的透明質(zhì)酸，在許多生物過程中起著非常重要的作用，具有重要的生理功能。它是自由基的“清道夫”，可調(diào)節(jié)膠原的合成，促進(jìn)細(xì)胞的增生和移動(dòng)，還參與一些基本的生物過程，如體內(nèi)由于HA的減少會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈硬化、皮膚老化等不良的癥狀，HA的補(bǔ)充能有效調(diào)節(jié)機(jī)體的功能和延緩皮膚老化的作用，HA是理想的功能食品和美容化妝品。目前，人們對(duì)HA的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生理功能都進(jìn)行了較為充分的研究，其在臨床上的應(yīng)用也日益廣泛[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，HA的部分生物活性與其分子的大小有密切關(guān)系，高分子HA與低分子HA(low molecular weight hyaluronic acid，LMWHA)具有不同的生物活性，甚至是相反的生物活性。透明質(zhì)酸雖具有很好的生理活性，但因其分子高度聚合，分子大，具有水不溶性或溶解度較低、溶膠穩(wěn)定性差、流動(dòng)性不好等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到限制。因此，LMWHA逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

近年來，有關(guān)透明質(zhì)酸的分子修飾已大有進(jìn)展，目前多糖的降解方法主要有酶法、化學(xué)法和物理法等，然而幾類方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：酶降解法無(wú)副反應(yīng)、降解條件溫和、對(duì)環(huán)境污染小，但是酶容易失活、降解時(shí)間長(zhǎng)；化學(xué)法降解高聚物反應(yīng)時(shí)間較短，但水解后的低聚糖容易受到酸和熱的影響而進(jìn)一步分解，操作難控制，導(dǎo)致產(chǎn)品均一性差，同時(shí)也有副產(chǎn)物生成，影響產(chǎn)品質(zhì)量，廢水處理量也大，不利于環(huán)境友好。物理法具有速度快、無(wú)副產(chǎn)物、無(wú)環(huán)境污染，是一種較理想的修飾方法。

目前，研究發(fā)現(xiàn)輻照能有效的降解纖維素、淀粉、殼聚糖、果膠等，而這些高分子鏈斷裂主要原因是在輻照過程中產(chǎn)生了自由基，自由基作用于高分子鏈，與它形成螯合物進(jìn)一步反應(yīng)，從而打斷了分子鏈，因此多糖的主要結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成隨著分子鏈的斷裂而發(fā)生不同程度的變化[9-11]。另外，許多的研究表明，輻照對(duì)松露、牛肉、藥草、香料、綠茶提取物、羽扇豆種子產(chǎn)品和大豆的抗氧化性影響比較大[12-14]，但是，輻照對(duì)透明質(zhì)酸的影響還沒有進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

本實(shí)驗(yàn)通過不同劑量輻照水溶液的透明質(zhì)酸，研究它對(duì)透明質(zhì)酸的理化性質(zhì)的影響，為進(jìn)一步開發(fā)利用透明質(zhì)酸提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

透明質(zhì)酸 江陰市潤(rùn)禾生物工程公司；二苯代苦?；杂苫?DPPH自由基) 美國(guó)Sigma公司；抗壞血酸(VC) 天津市博進(jìn)化有限公司；鐵氰化鉀、氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸、焦性沒食子酸(鄰苯三酚)、水楊酸等(分析純) 上海昊化化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

烏氏黏度計(jì)(內(nèi)徑57mm) 鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；P211 HANNA酸度計(jì) 北京哈納科技有限公司；R-550型可見分光光度計(jì) 日本分光株式會(huì)社；ENSOR37紅外光譜儀 布魯克光譜儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

用0.2mol/L NaCl溶液配制0.5g/100mL的透明質(zhì)酸溶液，分裝到8個(gè)250mL的滅菌的試劑瓶，每個(gè)試劑瓶裝200mL，待用。

1.3.2 輻照處理

在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行，采用60Co-γ輻照裝置進(jìn)行輻照，輻照劑量分別為0、1、3、5、8、10、20kGy和40kGy，處理后的樣品置于4℃冰箱保存。

1.3.3 透明質(zhì)酸黏均相對(duì)分子質(zhì)量及特性黏數(shù)的測(cè)定

采用烏氏黏度計(jì)，透明質(zhì)酸溶液的稀釋度以流出時(shí)間為準(zhǔn)，應(yīng)控制在120～180s范圍內(nèi)，一般用生理鹽水作20倍稀釋。采用一點(diǎn)法測(cè)量，按下(1)計(jì)算特性黏數(shù)：

式中：ηr為t/t0(t為兩次待測(cè)液體流出時(shí)間的平均值，t0為兩次溶劑流出的時(shí)間的平均值)；c為供試液的質(zhì)量濃度/(kg/L)。然后按照式(2)計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量。

式中：M為黏均相對(duì)分子質(zhì)量；[η]為特性黏數(shù)/ (cm3/g)。

透明質(zhì)酸pH值的測(cè)定：采用pH計(jì)測(cè)定。透明質(zhì)酸顏色L*、a*、b*值的測(cè)定：采用色度計(jì)測(cè)定。

1.3.4 透明質(zhì)酸對(duì)DPPH自由基清除作用

參照高春燕等[15]的方法，取2mL待測(cè)試樣的溶液加入2mL 0.16mmol/L DPPH 95%乙醇溶液于25℃反應(yīng)15min后，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai，以相同體積的0.2mol/L NaCl溶液代替試樣作為空白，以相同體積等濃度的VC溶液代替試樣作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)試樣作5個(gè)平行樣，取其平均值。按照式(3)計(jì)算清除DPPH自由基活性(P)。

式中：Ai為試樣的吸光度；Aj為VC的吸光度；Ac為空白樣的吸光度。

1.3.5 透明質(zhì)酸基團(tuán)結(jié)構(gòu)測(cè)定

采用UV進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描和特征吸收峰的測(cè)定，采用FTIR進(jìn)行測(cè)定基團(tuán)變化情況：液體樣品冷凍干燥后，與KBr粉末混合研磨、壓片，純KBr片作參比，1cm-1分辨率，多次掃描累積。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照對(duì)透明質(zhì)酸理化性質(zhì)的影響

2.1.1 輻照對(duì)透明質(zhì)酸黏均相對(duì)分子質(zhì)量的影響

從圖1可以看出，隨著輻照劑量的增大，透明質(zhì)酸平均相對(duì)分子質(zhì)量卻越來越來小，0～1kGy輻照處理，透明質(zhì)酸的相對(duì)分子質(zhì)量迅速降低，從1.03×106降低到6.54×104，隨著劑量升高，相對(duì)分子質(zhì)量降低的速度減慢。相對(duì)分子質(zhì)量降低的原因除γ射線的直接作用外，另一個(gè)重要的原因是在γ射線作用下，透明質(zhì)酸溶液中產(chǎn)生大量的自由基，自由基的形成加速了透明質(zhì)酸分子長(zhǎng)鏈的斷裂(β-1,3和β-1,4糖苷鍵)。

圖1 輻照對(duì)透明質(zhì)酸黏均相對(duì)分子質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of irradiation on average molecular weight of HA

2.1.2 輻照對(duì)透明質(zhì)酸特性黏數(shù)的影響

圖2 輻照對(duì)透明質(zhì)酸特性黏數(shù)的影響Fig.2 Effect of irradiation on the viscosity coefficient of HA

圖2可以看出，隨著輻照劑量的升高，透明質(zhì)酸的特性黏數(shù)也隨著降低。輻照劑量0～1kGy時(shí)，特性黏數(shù)降低的速度最快，從1652.51cm3/g降低到208.26cm3/g，而后，隨輻照劑量的增高，特性黏數(shù)降低的速度越慢。主要原因在于在γ射線的直接和間接作用下，透明質(zhì)酸的長(zhǎng)鏈變成短鏈，支鏈也被變短，輻照劑量越高，對(duì)分子鏈的作用越強(qiáng)，分子鏈變得越短，透明質(zhì)酸的相對(duì)分子質(zhì)量越小，因此，透明質(zhì)酸的特性黏數(shù)隨著劑量的升高就會(huì)降低，Lurie等[16]的研究結(jié)果與此相同。

2.1.3 輻照對(duì)透明質(zhì)酸pH值的影響

圖3 輻照對(duì)透明質(zhì)酸pH值的影響Fig.3 Effect of irradiation on pH of HA

由圖3可知，透明質(zhì)酸的pH值隨著輻照劑量的增大，p H值逐漸降低，酸性越來越強(qiáng)，輻照過后的透明質(zhì)酸的酸度增加，主要?dú)w于透明質(zhì)酸分子鏈打斷，可能形成了羧基的原因，Sokhey等[17]在1993報(bào)道過類似的結(jié)果：在自由基的作用下，糖苷鍵被打斷可以增加淀粉的酸度。

2.1.4 輻照對(duì)透明質(zhì)酸顏色的影響

表1 輻照對(duì)透明質(zhì)酸顏色的影響Table 1 Effect of irradiation on the color of HA

由表1可以看出，輻照引起透明質(zhì)酸色度的變化，輻照處理使透明質(zhì)酸的L*值明顯高于未輻照，使透明質(zhì)酸溶液的亮度略有增強(qiáng)；隨著輻照劑量的增加，＋b*逐漸增加(更黃)，-a*逐漸降低(更綠)，這表明輻照使透明質(zhì)酸溶液的顏色略有黃化。Choi等[18]研究表明，殼聚糖溶液的顏色隨著輻照劑量的增加，褐色變的更濃。Nagasawa等[19]研究結(jié)果表明，輻照使海藻酸鈉的顏色由淺褐色變成褐色，海藻酸鈉在輻照過程中形成的褐色是由于分子鏈的斷裂，產(chǎn)生了一些雙鍵。

2.1.5 透明質(zhì)酸對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖4 透明質(zhì)酸對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.4 Effect of irradiation on scavenging rate of DPPH free radicals

由圖4可以看出，隨著輻照劑量的增加，透明質(zhì)酸對(duì)DPPH自由基的清除率增大，當(dāng)輻照劑量高于20kGy時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率增加的緩慢。Alkrad等[20]研究表明，人體皮膚被紫外線照射過程中，就會(huì)產(chǎn)生大量的自由基。人體中的透明質(zhì)酸通過透明質(zhì)酸酶酶解后，透明質(zhì)酸中的吡喃羧酸環(huán)上就形成了一個(gè)雙鍵。吡喃羧酸環(huán)上雙鍵是清除人體內(nèi)自由基ROO·、·OH的毒性作用中是必不可少的。透明質(zhì)酸在輻照過程中，分子發(fā)生裂解，在吡喃羧酸環(huán)可能形成了雙鍵，因此，輻照處理后透明質(zhì)酸增強(qiáng)了對(duì)DPPH自由基的清除作用。

2.2 輻照處理后對(duì)透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 透明質(zhì)酸的紫外光譜分析

圖5 透明質(zhì)酸輻照前后紫外掃描Fig.5 UV spectra of irradiated hyaluronic acid

由圖5可見，透明質(zhì)酸經(jīng)紫外掃描，共出現(xiàn)2個(gè)峰，其中一個(gè)峰出現(xiàn)在波長(zhǎng)210nm附近，這是透明質(zhì)酸的吸收峰，另一個(gè)在波長(zhǎng)265nm處出現(xiàn)，這可能是透明質(zhì)酸的主鏈打斷后形成雙鍵而產(chǎn)生的，Kim等[21]報(bào)道過這種情況。經(jīng)過不同劑量輻照后，透明質(zhì)酸出峰的波長(zhǎng)及峰數(shù)沒有變化。說明輻照沒有產(chǎn)生新的吸收峰，但隨輻照劑量的增加，吸收峰的高度增高，Nagasawa等[19]報(bào)道峰的強(qiáng)度增大的原因可能是在γ射線作用下，主鏈斷裂形成一些雙鍵。

2.2.2 透明質(zhì)酸的紅外光譜分析

圖6 透明質(zhì)酸輻照前后紅外光譜掃描Fig.6 FT-IR spectra of irradiated hyaluronic acid

圖6顯示了輻照劑量在0、1、3、5、8、1 0、20kGy和40kGy輻照下的透明質(zhì)酸在4000～500cm-1區(qū)段紅外光譜的特征吸收峰，在3434cm-1出現(xiàn)了C＝O官能團(tuán)的特征吸收峰，在2360cm-1附近出現(xiàn)了C—O的特征吸收峰，1636cm-1處出現(xiàn)了C—O—C的特征吸收峰，1385cm-1附近出現(xiàn)了C—O和C—C官能團(tuán)特征吸收峰，1067cm-1處出現(xiàn)了—CHO的特征吸收峰，從整體上來看，雖然輻照降低了透明質(zhì)酸的相對(duì)分子質(zhì)量，但是紅外吸收光譜沒有發(fā)生太大的變化，只是隨著輻照劑量的增高，相應(yīng)的吸收峰的強(qiáng)度增大了。

3 結(jié) 論

3.1 透明質(zhì)酸經(jīng)過0、1、3、5、8、10、20、40kGy劑量輻照后，其相對(duì)分子質(zhì)量、特性黏數(shù)、p H值隨輻照劑量的增加而降低，透明質(zhì)酸溶液隨輻照劑量的增加顏色變黃，其對(duì)DPPH自由基的清除作用提高。這說明輻照不僅能降解透明質(zhì)酸，還能改變其一些理化特性，這為透明質(zhì)酸的應(yīng)用提供更多的選擇。

3.2 通過紫外光譜及紅外光譜的分析，輻照后的透明質(zhì)酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生改變，只是β-1,3和β-1,4糖苷鍵的斷裂，因此，輻照后的透明質(zhì)酸的物理特性發(fā)生改變。

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Effect of Irradiation on Physico-chemical Properties of Hyaluronic Acid

ZOU Zhao-hui1,2，WANG Qiang1，WANG Zhi-dong1，DENG Gang-qiao2，LI Shu-rong1,*，GAO Mei-xu1，CHEN Yong-hao1，F(xiàn)AN Bei1，LI Qing-peng1，ZHAO Hong-wei1
(1. Key Laboratory of Agricultural Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Institute of Agro-Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China；2. Institute of Atomic Energy Application in Agriculture, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125,China)

The60Co-γ irradiation treatment on 0.5 g/100mL hyaluronic acid (HA) with sodium chloride solution was used to explore the effect on its physico-chemical properties such as solution pH, viscosity, color and infrared spectroscopy and UV spectra. The results demonstrated that the irradiation treatment could decrease molecular weight, viscosity and pH of hyaluronic acid, and result in enhanced yellow color. In addition, no obvious change in absorption characteristic peaks of UV and FT-IR for the irradiated hyaluronic acid solution was observed; however, its absorption intensity was changed due to the irradiation treatment. Moreover, the irradiated hyaluronic acid exhibited a gradual increase trend of scavenging capability on DPPH free radicals in a dose-dependent manner.

hyaluronic acid；irradiation；depolymerization；physico-chemical property

TS201.2

A

1002-6630(2011)03-0117-04

2010-06-07

鄒朝暉(1976—)，男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)檩椪帐称芳庸ぁ?/p>

E-mail：zouzhaohui1976@yahoo.com.cn

*通信作者：李淑榮(1968—)，女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：shurongl@hotmail.com