通過花粉管通道法導入紅樹總DNA獲得耐鹽紫花苜蓿T0代植株及其RAPD驗證

張立全,牛一丁,郝金鳳,哈斯阿古拉

(內(nèi)蒙古大學生命科學學院內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特010021)

土壤鹽堿化是一個世界性的問題,培育抗鹽轉(zhuǎn)基因作物新品種,充分利用鹽堿地,具有重要意義[1]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行育種即可以有效地打破物種界限,又可達到定向改良植物的目的[2]。然而,植物的耐鹽性是多種耐鹽代謝、生理過程綜合表現(xiàn)的結(jié)果,受多個基因控制[3]。因此,培育轉(zhuǎn)基因耐鹽植物時,轉(zhuǎn)移單個基因往往只能獲得部分耐鹽性。為了獲得具有應(yīng)用價值的耐鹽植物品種,可能需要直接轉(zhuǎn)移耐鹽供體基因組DNA,花粉管通道法(pollen-tube pathway)[4]轉(zhuǎn)基因技術(shù)的創(chuàng)建使其成為可能。利用鹽生植物DNA直接導入受體來培育耐鹽植物已有許多成功的報道。林棲鳳等[5-8]開展了耐鹽作物分子育種研究,將海岸鹽生植物紅樹(Rhizophora apiculata)DNA 導入番茄(Lycopersicon esculentum)[5]、豇豆(Vigna sesquipedalis)[6]、茄子(Solanum melongena)[7]、辣椒(Capsicum annuum)[8],獲得了耐鹽能力明顯增強的變異后代。肖軍等[9]將堿蓬(Suaeda salsa)總DNA導入番茄,獲得了抗鹽植株。以上研究證實直接轉(zhuǎn)移供體基因組DNA進行作物耐鹽性育種是可行的。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培面積最大的優(yōu)質(zhì)豆科牧草[10,11],而利用基因工程技術(shù)來提高苜?？购?、抗旱、耐鹽堿能力以及改良其營養(yǎng)品質(zhì)已成為苜蓿發(fā)展和研究的新趨勢和重點[12]。張改娜和賈敬芬[13]將豌豆清蛋白1(PA1)基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)PA1基因再生植株中蛋氨酸和半胱氨酸的含量提高4倍。Winicov和Bastola[14]將轉(zhuǎn)錄因子基因Aflin1導入苜蓿,超表達Af lin1的愈傷組織可抵抗171 mmol/L NaCl的脅迫作用。燕麗萍等[15]對轉(zhuǎn)BADH基因T1代苜蓿的抗鹽性進行了研究,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯高于對照。以上研究均是利用農(nóng)桿菌介導法,而且導入的均是單一基因,有關(guān)導入基因組DNA來培育苜蓿新品種尚未見相關(guān)報道。

本研究利用花粉管通道法,將鹽生植物紅樹總DNA直接導入紫花苜蓿,對獲得的T0代植株進行耐鹽性篩選和隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分子鑒定,旨在為紫花苜蓿耐鹽育種提供新的種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供體:鹽生植物紅樹采自深圳市紅樹海濱生態(tài)公園。

受體:紫花苜蓿阿爾岡金(Algonguin)品種,種子由中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所于林清研究員提供,2005年種植于內(nèi)蒙古大學生命科學學院花房試驗田。

1.2 方法

1.2.1 外源DNA的導入 十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)法[16]提取紅樹總DNA,用 TE緩沖液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,pH8.0)回溶,0.1×SSC(1×SSC:150 mmol/L氯化鈉,15 mmol/L檸檬酸鈉)稀釋至終濃度為250 ng/μ L,-20℃凍存?zhèn)溆谩?007年6月和2008年6月連續(xù)2年的盛花期,在晴天上午8時選擇當天新開放的花朵,人工輔助異花授粉。授粉后24 h時切去1/2柱頭,用微量進樣器在柱頭切口處滴加5 μ L紅樹DNA溶液,共導入1 391朵,按常規(guī)方法進行栽培管理,莢果成熟時采摘收集T0代轉(zhuǎn)化種子。

1.2.2 T0代植株的鹽脅迫篩選 取未轉(zhuǎn)基因種子,砂紙輕輕打磨,70%酒精表面消毒10 min后,0.1%的升汞消毒10 min,無菌水沖洗4～5次,播種在NaCl濃度為0,50,75,100,125,150,175,200,225和250 mmol/L的MS培養(yǎng)基上,每個培養(yǎng)皿播種20粒種子,重復3次。培養(yǎng)2周后,統(tǒng)計發(fā)芽率。取T0代轉(zhuǎn)化種子,表面消毒后種植在含225 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上,培養(yǎng)2周后,將正常發(fā)芽且生長主根和真葉的植株移栽至不含NaCl的MS培養(yǎng)基上,培養(yǎng)3周,移栽至花盆,獲得耐鹽 T0代植株。

1.2.3 耐鹽性 T0代植株RAPD分析 取耐鹽性T0代植株葉片,采用十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate,SDS)法提取DNA[17]。選用上海生工生物工程公司S編號的隨機引物55條,以紅樹DNA和未轉(zhuǎn)化紫花苜蓿DNA為模板,選出擴增產(chǎn)物清晰、穩(wěn)定的引物,對耐鹽性T0代植株DNA樣品進行RAPD分析。PCR反應(yīng)體系 25 μ L:10 ×緩沖液 2.5 μ L,MgCl2(25 mmol/L)2.0 μ L,dNTP(各 2.5 mmol/L)2.0 μ L,引物(5 pmol/μ L)2.0 μ L,DNA 模板 100 ng,Taq 酶(5 U/μ L)0.3 μ L,補蒸餾水至25 μ L。PCR 反應(yīng)條件 :95 ℃預(yù)變性 5 min;95℃變性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸2 min,45個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在3.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析,溴化乙錠染色后用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。試驗設(shè)2次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 T0代種子的獲得

2007和2008年2年共導入1 391朵花,獲得莢果445個,收集飽滿種子894粒,結(jié)莢率為32.0%,結(jié)籽率為2.01粒/莢。

2.2 T0代植株耐鹽性篩選

未轉(zhuǎn)基因種子在含0,50,75,100,125,150,175,200,225,250 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上種子發(fā)芽率分別為95.0%(圖1A),90.0%,85.0%,70.0%,47.5%,30.0%,22.5%,12.5%,0(圖 1B),0,即225 mmol/L 的NaCl濃度是篩選耐鹽性種子的適合濃度。

圖1 225 mmol/L NaCl篩選T0代植株Fig.1 T0seedlings selected by 225 mmol/L NaCl

將收獲的894粒T0代種子播種在含225 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)2周后,有12粒正常發(fā)芽,且長有發(fā)育良好的真葉、主根和側(cè)根(圖1C)。移栽至不含NaCl的MS培養(yǎng)基上,培養(yǎng)3周,移栽至花盆,獲得耐鹽性 T0代植株,編號分別為:Ms-ra1～Ms-ra12。

2.3 RAPD分析

選用55條 RAPD引物對供體和受體基因組DNA進行PCR擴增,篩選得到清晰擴增產(chǎn)物、重復性好的8條引物(表1)。利用選定的8條引物對12株T0代植株進行RAPD分析,同時以供體DNA和受體DNA作對照。觀測所有的擴增電泳條帶,8條引物擴增出36條條帶,擴增產(chǎn)物分子量為0.17～2.50 kb(圖2)。多態(tài)性主要表現(xiàn)為供體和受體均沒有的新增條帶、供體特異條帶、受體條帶丟失3種情況(表2)。

表1 RAPD引物序列Table 1 Sequences of RAPD primers

圖2 RAPD分析圖譜Fig.2 The patterns of RAPD analysis

所獲得的12株植株均有大小不等的供體特異條帶出現(xiàn)(圖2,表2),S178引物在5個植株(Ms-ra3、Ms-ra6、Ms-ra8、Ms-ra11、Ms-ra12)中出現(xiàn)供體特異條帶,大小約 0.7和0.9 kb。S198在4個植株(Ms-ra1、Ms-ra5、Msra6、Ms-ra11)中均有供體特異條帶的出現(xiàn),大小約為0.90 kb;S180在植株Ms-ra5和Ms-ra6中均出現(xiàn)了2條供體特異條帶,大小約為0.55和0.65 kb,而在植株Ms-ra2、Ms-ra4和Ms-ra11中也有約0.65 kb的供體特異條帶出現(xiàn);S144在所有植株中都有約0.45 kb大小的供體特異條帶。除Ms-ra6、Ms-ra7、Ms-ra10和Ms-ra11外,其余均出現(xiàn)了供體和受體都沒有的新增條帶。S198在 5個植株(Ms-ra3、Ms-ra4、Ms-ra5、Ms-ra11、Ms-ra12)中出現(xiàn)了新增條帶,而有4個引物(S67、S105、S180、S144)在植株Ms-ra2中出現(xiàn)了新增條帶。同時,各植株均有受體條帶丟失現(xiàn)象,其中引物S178在所有轉(zhuǎn)化植株中都丟失約1.20 kb的受體條帶,S1407在各轉(zhuǎn)化植株中的受體條帶丟失現(xiàn)象更為明顯。

表2 RAPD多態(tài)性分析Table 2 The polymorphisms of RAPD analysis

3 討論

本研究以紅樹總DNA為供體,利用花粉管通道法獲得了紫花苜蓿耐鹽新種質(zhì),在225 mmol/L NaCl脅迫條件下,獲得12株正常生長的植株,而未轉(zhuǎn)基因種子在225 mmol/L NaCl脅迫時,不能正常發(fā)芽,表明已獲得了比對照耐鹽性顯著增強的T0代植株。

以PCR為基礎(chǔ)的RAPD技術(shù)可以檢測基因組上的微小差異[18],因此,RAPD技術(shù)已成為驗證外源DNA是否導入受體的有效手段,并有許多研究得到了證實[8,19,20]。本研究RAPD結(jié)果顯示,12個T0代耐鹽植株大多數(shù)條帶與受體一致,但也明顯出現(xiàn)有供體的特異條帶,表明已有外源DNA導入并整合到受體基因組中。由于外源DNA的導入并整合在受體基因組中,導致了后代基因組DNA在一級結(jié)構(gòu)上發(fā)生改變,可能會改變導入后代基因組某些片段的引物結(jié)合位點,從而會導致新的DNA條帶出現(xiàn)或受體原有條帶丟失。這些結(jié)果表明供體紅樹DNA已整合在所獲得的12株耐鹽植株基因組中。

[1］趙可夫,李法曾.中國鹽生植物[M].北京:科學出版社,1999.

[2］崔潤麗,刁現(xiàn)民.植物耐鹽相關(guān)基因克隆與轉(zhuǎn)化研究進展[J].中國生物工程雜志,2005,25(8):25-29.

[3］Mccuc K F,Hanson A D.Drought and salt tolerance:Towards understanding and application[J].T rends in Biotechnology,2000,8:358-362.

[4］Zhou G Y,Weng J,Zeng Y,et al.Introduction of exogenous DNA into cotton embryos[J].Methods in Enzymology,1983,101:433-481.

[5］林棲鳳,方清,鄧用川,等.耐鹽番茄分子育種研究[J].生命的化學,2004,24:35-37.

[6］林棲鳳,鄧用川,李冠一,等.外源DNA導入豇豆提高耐鹽能力的研究[J].生物化學雜志,1997,10:454-455.

[7］林棲鳳,鄧用川,李冠一,等.紅樹DNA導入茄子獲得耐鹽性后代的研究[J].生物工程進展,2001,21(5):40-44.

[8］林棲鳳,鄧用川,吳多桂,等.耐鹽辣椒分子育種[J].生物工程進展,1999,19(5):19-24.

[9］肖軍,張立軍,任志瑩,等.通過花粉管通道導入外源DNA獲得抗鹽番茄新品系[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2008,39(3):362-364.

[10］耿華珠,吳永敷,曹致中,等.中國苜蓿(第一版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1995.

[11］馬春暉,夏艷軍,韓軍,等.不同青貯添加劑對紫花苜蓿青貯品質(zhì)的影響[J].草業(yè)學報,2010,19(1):128-133.

[12］劉青芳,步懷宇,趙宇瑋,等.紫花苜蓿離體培養(yǎng)植株再生及其RAPD分析[J].草業(yè)學報,2006,15(5):115-121.

[13］張改娜,賈敬芬.豌豆清蛋白1(AP1)基因的克隆及對苜蓿的轉(zhuǎn)化[J].草業(yè)學報,2009,18(3):117-125.

[14］Winicov I,Bastola D R.Transgenic overexpression of the transcription factor Alfin1 enhances expression of the endogenous M sPRP2 gene in Alfalfa and improves salinity tolerance of the plants[J].Plant Physiology,1999,120:473-480.

[15］燕麗萍,夏陽,梁慧敏,等.轉(zhuǎn)BADH基因苜蓿T1代遺傳穩(wěn)定性和抗鹽性研究[J].草業(yè)學報,2009,18(6):65-71.

[16］吳多桂,林棲鳳,李冠一.紅樹DNA的CTAB法提取及其RAPD反應(yīng)[J].中國生物化學及分子生物學報,1999,15(1):67-70.

[17］王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程(第二版)[M].北京:科學出版社,2002.

[18］Atienzar F A,Jha A N.The random amplified polymorphic DNA(RAPD)assay and related techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies:A critical review[J].Mutation Research,2006,613:76-102.

[19］王松文,趙炳然,邢全華,等.野生稻DNA片段存在于高世代水稻變異系進一步的分子驗證[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2006,39(11):2170-2177.

[20］李希臣,雷勃鈞,盧翠華,等.早熟大豆外源DNA導入的RAPD分子驗證[J].大豆科學,1994,13(2):152-156.