黑皮素-1受體在瘢痕疙瘩中的表達(dá)及基因沉默黑皮素-1受體對成纖維細(xì)胞增殖的影響

呂川 戴海英 張敬德 王曉蕓

黑皮素-1受體在瘢痕疙瘩中的表達(dá)及基因沉默黑皮素-1受體對成纖維細(xì)胞增殖的影響

呂川 戴海英 張敬德 王曉蕓

目的檢測黑皮素-1受體（MC-1R）在瘢痕疙瘩中的表達(dá)，同時(shí)研究基因沉默黑皮素-1受體對成纖維細(xì)胞增殖的影響。方法用MTT法比較α-MSH對正常皮膚成纖維細(xì)胞（hDF)和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（hKF）增殖能力的影響；用qPCR法檢測正常皮膚及瘢痕疙瘩組織中MC-1R的表達(dá)水平；用MTT法檢測RNA干擾MC-1R基因后對α-MSH抑制hDF增殖能力的影響。結(jié)果α-MSH可抑制hDF的增殖，而未對hKF的增殖產(chǎn)生明顯影響；與正常皮膚組織相比，瘢痕疙瘩組織中MC-1R的mRNA表達(dá)水平明顯下降，而α-MSH的表達(dá)增加；最后，將hDF轉(zhuǎn)染MC-1R siRNA后，α-MSH對其增殖能力的抑制程度顯著降低。結(jié)論瘢痕疙瘩中MC-1R表達(dá)降低，導(dǎo)致α-MSH抑制hKF增殖的功能無法實(shí)現(xiàn)，促進(jìn)了瘢痕疙瘩的形成。

瘢痕疙瘩黑皮素-1受體促黑素細(xì)胞激素成纖維細(xì)胞增殖

瘢痕疙瘩多發(fā)生于選擇性手術(shù)或創(chuàng)傷術(shù)后，組織學(xué)上以成纖維細(xì)胞的過度增殖和膠原過度合成為特征，但目前對其復(fù)雜的機(jī)制了解甚少，尚無有效治療方法[1]。促黑素細(xì)胞激素（Melanocyte-stimul-ating hormone，MSH）是一種內(nèi)源性神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)肽，可分為α-MSH、β-MSH、γ-MSH等3種。近年來，越來越多的研究表明，α-MSH通過作用于其受體黑皮素-1受體（MC-1R）參與調(diào)節(jié)瘢痕的形成過程。本實(shí)驗(yàn)通過對比瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中MC-1R的表達(dá)，以及基因沉默正常成纖維細(xì)胞中的MC-1R，研究α-MSH及其受體在瘢痕疙瘩形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

siRNA由上海吉瑪生物制藥公司合成，序列為5'-CGUGAUCACCUGCAGCUCCUU-3'，5'-AAGGAGCTGCAGGTGATCACG-3'。siRNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Interferin）購自法國Polyplus公司，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma公司，Trizol試劑和RT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司，α-MSH為德國Biosciences公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)對象

正常皮膚和瘢痕疙瘩組織各8例，供者均系本科患者，并征得患者知情同意?；颊吣挲g16～48歲，男7例，女9例。標(biāo)本切取后一部分應(yīng)用組織塊法進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)；其余部分在30 min內(nèi)放入液氮中，置入-80℃冰箱中保存，待提取細(xì)胞總RNA。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織塊培養(yǎng)法

無菌切取正常皮膚標(biāo)本、瘢痕疙瘩標(biāo)本，75%乙醇浸泡2 min，PBS沖洗2次后，剪成約1 mm3碎塊，置于25 cm2的培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，倒置放入孵箱，7 h左右輕輕翻正，在37℃、5%CO2和95%濕度條件下培養(yǎng)。以后每3天換液1次。待成纖維細(xì)胞從組織塊邊緣長出，達(dá)80%亞匯合狀態(tài)時(shí)，按1∶3傳代培養(yǎng)。第4～7代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2realtime RT-PCR檢測

使用Trizol（購自Invitrogen公司）試劑提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自Toyobo公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。定量PCR引物序列為，MC-1R：5'-CCTGCTGGTGAGCGGGA-3'（上游），5'-ACGGCCATGAGCACCAG-3'（下游）；α-MSH：5'-TAAGGACAGAGGAGCGCGGGA-3'（上游），5'-TCTCCTGGTGGAACAGCCACTG-3'（下游）；β-actin：5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'（上游），5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'（下游）。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，共循環(huán)40次，由羅式Lightcycler 1.5定量PCR儀檢測并計(jì)算分析Ct值，相對定量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.3MTT法檢測

取對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)液中加入MTT，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min溶解。波長570 nm下，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值，檢測成纖維細(xì)胞的增殖情況。

1.3.4RNA干擾

1×104個(gè)細(xì)胞鋪入96孔板中并培養(yǎng)過夜，次日使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Interferin轉(zhuǎn)染siRNA，按說明書標(biāo)準(zhǔn)操作，轉(zhuǎn)染終濃度為40 nM。

1.3.5Western blot檢測

蛋白濃度檢測使用BCA蛋白定量試劑盒（購自Pierce公司）。Western blot按標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行，MC-1R、β-actin及相應(yīng)HRP酶標(biāo)二抗均購自Santa Cruz公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

組間差異采用Student’s t檢驗(yàn)計(jì)算，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-MSH對正常皮膚和瘢痕疙瘩兩種來源成纖維細(xì)胞的作用

將正常皮膚成纖維細(xì)胞（hDF)和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（hKF）分別分為2組，一組為對照組，用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，另一組為α-MSH處理組，在培養(yǎng)基中加入終濃度為10-6mmol/L的α-MSH處理細(xì)胞。處理0 h、48 h和96 h后，用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，α-MSH可抑制hDF的增殖能力（圖1左），而未對hKF的增殖產(chǎn)生明顯影響（圖1右）。

圖1 α-MSH對正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig.1The effect of α-MSH on the proliferation of fibroblasts derived from normal skin and keloids

圖2 qPCR檢測正常皮膚和瘢痕組織中MC-1R和α-MSH的mRNA表達(dá)水平Fig.2The expression of MC-1R and α-MSH mRNA in normal skin and keloids by qPCR

2.2qPCR檢測正常皮膚和瘢痕疙瘩組織中MC-1R和α-MSH的mRNA表達(dá)水平

與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩組織中MC-1R表達(dá)水平降低（圖2A），而α-MSH水平升高（圖2B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示hKF表型發(fā)生了改變，MC-1R表達(dá)減少，而α-MSH代償性升高。

2.3 MC-1R RNA干擾的效果分析

hDF細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染MC-1R siRNA 48 h及72 h后，通過檢測MC-1R mRNA發(fā)現(xiàn)：MC-1R siRNA能夠顯著抑制MC-1R mRNA的表達(dá)（圖3A）。通過轉(zhuǎn)染后72 h檢測MC-1R蛋白水平發(fā)現(xiàn)，MC-1R的蛋白表達(dá)水平也能被MC-1R的siRNA抑制（圖3B）。這些結(jié)果證明了MC-1R RNA干擾的有效性。

圖3 MC-1R RNA干擾的效果分析Fig.3The knockdown efficacy of MC-1R siRNA

2.4MC-1R RNA干擾對α-MSH抑制hDF增殖作用的影響

hDF經(jīng)轉(zhuǎn)染MC-1R siRNA后，用α-MSH分別處理0 h、48 h和96 h，然后用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，將hDF的MC-1R基因沉默后，α-MSH不能發(fā)揮對hDF增殖能力的抑制作用。在α-MSH處理后，與轉(zhuǎn)染對照組相比，轉(zhuǎn)染MC-1R siRNA的hDF增殖能力強(qiáng)，差異顯著（P＜0.05）（圖4）。

圖4 MC-1R RNA干擾對α-MSH抑制hDF增殖作用的影響Fig.4The influence of MC-1R siRNA on the α-MSH inhibitory effect of hDF proliferation

3 討論

異常的創(chuàng)傷愈合會(huì)導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成，典型癥狀為超出原傷口界限向周圍組織侵入性生長，表面光滑，存在時(shí)間長，不能自愈，切除后易復(fù)發(fā)，可造成局部瘙癢、疼痛以及攣縮，給患者帶來生理和心理上的痛苦[2－3]。瘢痕疙瘩的形成經(jīng)過3個(gè)病理階段，分別為炎癥期、增殖期和成熟期，成纖維細(xì)胞是這一過程中的效應(yīng)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞的過度增殖和功能活躍導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積是瘢痕疙瘩的組織學(xué)基礎(chǔ)[4]。

MSH是一種內(nèi)源性神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)肽，可分為α-MSH、β-MSH、γ-MSH 3種。最早發(fā)現(xiàn)α-MSH的生物功能主要是調(diào)控皮膚色素沉著過程。黑皮素受體（Melanocortin receptor，MCR）共有5種亞型：MC-1R、MC-2R、MC-3R、MC-4R和MC-5R，正常黑素細(xì)胞可表達(dá)多種MCR，而成纖維細(xì)胞僅表達(dá)MC-1R[5]。

瘢痕疙瘩的形成可能與MSH的異常代謝有關(guān)，且眾多臨床現(xiàn)象也支持這一結(jié)論：①黑種人瘢痕疙瘩發(fā)生率高，該人種的黑素細(xì)胞對MSH的刺激反應(yīng)敏感；②白化病患者很少發(fā)生瘢痕疙瘩；③瘢痕疙瘩主要發(fā)生在身體黑素細(xì)胞較多的部位，而在黑素細(xì)胞較少的部位如手掌、足底等處，則罕見瘢痕疙瘩發(fā)生；④瘢痕疙瘩在垂體功能活躍期，如青春期和妊娠期發(fā)病率高，該期伴隨著皮膚色素增加；⑤氫化可的松類藥物可抑制瘢痕疙瘩的生長，這種類固醇藥物具有抑制MSH產(chǎn)生的作用[6－7]。也有研究顯示，瘢痕疙瘩組織中α-MSH水平明顯高于正常瘢痕及正常皮膚組織[8]。上述結(jié)果提示，α-MSH與瘢痕疙瘩的形成有正向調(diào)控關(guān)系。

同時(shí)又有更多文獻(xiàn)證實(shí)，α-MSH可能對瘢痕形成具有抑制性的調(diào)控作用。α-MSH可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌膠原酶，而膠原酶是分解細(xì)胞外基質(zhì)的重要蛋白酶，是抑制瘢痕形成的重要環(huán)節(jié)[9]；α-MSH還可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞膠原的合成[10]。白介素-1(IL-1)可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌IL-8，α-干擾素可激活成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1)并誘導(dǎo)其生成細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1），而α-MSH可通過抑制以上機(jī)制而進(jìn)行免疫調(diào)控，拮抗炎癥反應(yīng)，最終抑制膠原合成和促進(jìn)膠原降解[11]。由于成纖維細(xì)胞發(fā)生表型改變是瘢痕形成過程中的關(guān)鍵事件，與正常成纖維細(xì)胞相比，瘢痕中的成纖維細(xì)胞高表達(dá)生長因子受體，使其更迅速對PDGF和TGF-β等生長因子做出應(yīng)答，從而有利于瘢痕形成[12]。因此，我們假設(shè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（hkF）中α-MSH受體異常，從而使得α-MSH無法實(shí)現(xiàn)對瘢痕形成的抑制性調(diào)控。

本實(shí)驗(yàn)研究了α-MSH對成纖維細(xì)胞增殖的作用。MTT結(jié)果顯示，α-MSH可抑制hDF的增殖，而對hKF增殖的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過qPCR檢測了瘢痕疙瘩和正常皮膚中MC-1R和α-MSH的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常皮膚組織相比，瘢痕疙瘩組織中MC-1R的mRNA表達(dá)水平明顯下降，而α-MSH的表達(dá)增加；將hDF轉(zhuǎn)染MC-1R siRNA后，α-MSH對其增殖能力的抑制程度顯著降低。以上結(jié)果驗(yàn)證了我們的假設(shè)，說明α-MSH通過與其受體MC-1R結(jié)合，發(fā)揮對成纖維細(xì)胞增殖的負(fù)向調(diào)控；而hkF中MC-1R表達(dá)降低，導(dǎo)致α-MSH功能無法實(shí)現(xiàn)，并出現(xiàn)代償性高表達(dá)，最終成纖維細(xì)胞增殖過快促進(jìn)瘢痕疙瘩的形成。本實(shí)驗(yàn)為深入了解瘢痕疙瘩的形成提供了新的證據(jù)，并為瘢痕疙瘩的有效治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Gauglitz GG,Korting HC,Pavicic T,et al.Hypertrophic scarring and keloids:pathomechanisms and current and emerging treatment strategies[J].Mol Med,2011,17(1-2):113-125.

[2]Peacock EE Jr,Madden JW,Trier WC.Biologic basis for the treatment of keloids and hypertrophic scars[J].South Med J,1970,

The Expression of Melanocortin 1 Receptor in Keloids and the Effects of Its Gene Silencing in Fibroblasts Proliferation

ObjectiveTo investigate the expression of melanocortin 1 receptor(MC-1R)in keloids and the effects of its gene silencing in fibroblasts proliferation.MethodsThe effects of α-MSH on the proliferation of normal dermal fibroblast (hDF)and keloids fibroblast(hKF)were detected by MTT assay;The expression of MC-1R mRNA was detected by qPCR in normal skin tissue and keloids;After the gene silencing of MC-1R,the proliferation of hDF inhibited by α-MSH was detected by MTT assay.Resultsα-MSH could inhibit the proliferation of hDF rather than hKF;Compared with normal skin tissue,the expression of α-MSH mRNA was increased in keloids while the expression of MC-1R mRNA was decreased; After the transfection of MC-1R siRNA,the inhibitory effect of α-MSH on hDF proliferation was decreased obviously. Conclusion The expression of MC-1R is decreased in keloids,which leads to malfunction of proliferation-inhibitory effect of α-MSH and finally results in keloids formation.

Keloids;Melanocortin 1 receptor;Α-melanocyte-stimulating hormone;Fibroblast;Proliferation

R619+.6

A

1673－0364（2011）03－0147－04

LU Chuan,DAI Haiying,ZHANG Jingde,WANG Xiaoyun.
Department of Plastic Surgery,Changhai Hospital,The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.Corresponding author:ZHANG Jingde(E-mail: E-mail：zhangjd789@sohu.com).

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.007

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（09ZR1400600）。

200433上海市第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院整形外科。

張敬德（E-mail：zhangjd789@sohu.com）。