蘿卜與大頭菜屬間雜種胚的離體培養(yǎng)

甘彩霞，何云啟，崔磊，梅雪飛，梅時(shí)勇

（湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物所，武漢，430072）

蘿卜與大頭菜屬間雜種胚的離體培養(yǎng)

甘彩霞，何云啟，崔磊，梅雪飛，梅時(shí)勇

（湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物所，武漢，430072）

用蘿卜雄性不育系DH303A作母本，以大頭菜為父本進(jìn)行屬間遠(yuǎn)緣雜交，雜交后代的初期結(jié)莢率為64%～88%，橫徑第7天停止增加，莢長第8天停止生長，授粉以后第7天開始敗育，而且越往后敗育得越快。在雜種胚發(fā)育后5～8 d進(jìn)行胚搶救，用生芽培養(yǎng)基（1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5%活性炭）和生根培養(yǎng)基（1/2 MS+ 0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.5%活性炭）進(jìn)行離體培養(yǎng)，能成功獲得幼苗。

蘿卜；大頭菜；遠(yuǎn)緣雜交；胚搶救；離體培養(yǎng)

蘿卜（Raphanus sativusL.）是我國栽培的主要蔬菜作物之一，十字花科蘿卜屬，一、二年生草本植物。原產(chǎn)我國，各地均有栽培，品種極多，常見有白皮蘿卜、紅皮蘿卜、青皮蘿卜等。鮮食生食均可，種子含油42%，可用于制肥皂或作潤滑油。種子、鮮根、葉均可入藥，可下氣消積，生蘿卜含淀粉酶，能助消化[1]。大頭菜（Brassica juncea Coss.var.napiformmisPal et.Bols）是芥菜的一個(gè)變種，為根用芥菜，是十字花科蕓薹屬二年生草本植物。其產(chǎn)品器官為肉質(zhì)根，質(zhì)地緊密、水分少、纖維多，肉質(zhì)根錐形，肉白色，肉質(zhì)堅(jiān)實(shí)，有強(qiáng)烈的芥辣味，具有宜肺豁痰、開胃理氣的作用。芥菜含有豐富的維生素和大量的微量元素、糖類、蛋白質(zhì)等，供食部分為肥大的肉質(zhì)根[2]。蘿卜和大頭菜均為根用蔬菜，但二者的風(fēng)味不同。到目前為止，還沒有關(guān)于二者遠(yuǎn)緣雜交研究方面的報(bào)道。為此，本試驗(yàn)將兩種材料進(jìn)行屬間雜交，初步研究雜交親和性的表現(xiàn)，以及對(duì)雜種胚搶救培養(yǎng)方法進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以蘿卜雄性不育系DH303A為母本 （2n=18），大頭菜作為父本（2n=18），試驗(yàn)材料種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜科技研究中心的試驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在湖北省農(nóng)科院蔬菜科技中心進(jìn)行。

①播種 大頭菜和蘿卜種子播種在試驗(yàn)大棚里，常規(guī)田間管理。

②套袋、掛牌 蘿卜和大頭菜抽薹后套袋，如果套袋之前已有開放的花，要將花摘掉。蘿卜雄性不育系每個(gè)單株單獨(dú)套袋，掛牌編號(hào)標(biāo)記，共10個(gè)單株，所有的數(shù)據(jù)取10個(gè)單株的平均值；大頭菜不分單株，混合給蘿卜授粉。

③授粉 套袋以后，蘿卜與大頭菜開花時(shí)，進(jìn)行人工授粉。授粉一般在早上10：00和下午15：00進(jìn)行。授粉的方法：a.在授粉之前首先用水將手洗干凈，然后再用酒精消毒。b.打開紗網(wǎng)袋，摘下已經(jīng)盛開的大頭菜的花朵，摘完以后立即將紗袋封好。c.再打開蘿卜植株的紗網(wǎng)袋，將大頭菜的花粉授到蘿卜的柱頭上。為了增加花粉與柱頭的親和性，試驗(yàn)采肖成漢[3]的重復(fù)授粉法，即在第1次授粉后的第2天上午再授粉1次），對(duì)克服屬間雜交不親和，提高結(jié)籽率效果較好。

按以上方法連續(xù)授粉7 d，并注意觀察花粉與柱頭的親和性。統(tǒng)計(jì)授粉花朵數(shù)、初期結(jié)莢數(shù)，計(jì)算初期結(jié)莢率，初期結(jié)莢率 （%）=（初期得到的莢果數(shù)/授粉花朵數(shù)）×100%。

④胚胎搶救 胚胎搶救的常規(guī)方法有3種：子房培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、胚培養(yǎng)[4]。本試驗(yàn)采用的是第2種方法——胚珠培養(yǎng)。

在試驗(yàn)田取授粉后第3～9天的莢果，用小刀把果柄去掉。將莢果先用無菌水沖洗一遍，然后用70%的酒精消毒30 s，再用0.1%升汞消毒8～10 min，最后用無菌水清洗3遍，每遍清洗3 min。將消毒好的莢果放到已經(jīng)滅菌的帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，把莢果上的水分吸干，然后小心地用小刀把胚珠從莢果里剝出來，接種到裝有生芽培養(yǎng)基（表1）的培養(yǎng)皿上，操作時(shí)要注意無菌、以免污染，一般一個(gè)培養(yǎng)皿上接種4～5個(gè)胚珠。接種完以后用封口膜把培養(yǎng)皿封好，放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是25℃，光照16 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx，培養(yǎng)30～60 d。觀察胚珠在培養(yǎng)基上的生長情況，做好記載。將已經(jīng)長出的子葉苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基（表1）上，獲得試管苗。

表1 雜種胚珠培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方

表2 授粉花朵數(shù)和結(jié)莢數(shù)

胚胎搶救期間，a.測(cè)量莢縱徑和橫徑；取莢果之前對(duì)每天授粉以后莢果的發(fā)育情況進(jìn)行記載，測(cè)量莢長、莢的橫徑。b.統(tǒng)計(jì)結(jié)莢率。c.觀察并統(tǒng)計(jì)雜種胚珠培養(yǎng)的出苗率；通過胚珠培養(yǎng)的結(jié)果確定蘿卜與大頭菜遠(yuǎn)緣雜交胚搶救的最佳時(shí)期。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜與大頭菜屬間雜交的結(jié)莢率

由表2可知，雜交后的初期結(jié)莢率為64%～88%，平均初期結(jié)莢率為74%。

2.2 蘿卜與大頭菜遠(yuǎn)緣雜交形成莢果的生長

從表3可以看出，授粉以后莢果便開始生長，到第8天莢長停止增加，而橫徑第7天停止生長。而且此時(shí)很多莢外觀已變黃，胚已經(jīng)開始敗育。因此蘿卜與大頭菜雜交胚的胚搶救最好是在莢停止生長、胚敗育之前即授粉后第7天進(jìn)行。

2.3 蘿卜與大頭菜遠(yuǎn)緣雜交胚搶救的適宜時(shí)期

蘿卜與大頭菜雜交形成雜種胚以后，在一定時(shí)間以后就會(huì)出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，即胚黃化萎縮、停止生長，最后脫落。從表3可以看出，授粉以后第7天雜交胚開始敗育，而且越往后敗育得越快。

由表3可以看出，授粉以后前4天和第8天以后的雜種胚珠培養(yǎng)都沒有獲得成功苗，授粉后第5～8天培養(yǎng)均獲得成功苗。說明蘿卜與大頭菜屬間雜交胚搶救的最佳時(shí)期在授粉后第5～8天。

表3 授粉后莢果縱徑、橫徑，結(jié)莢情況及胚生長和出苗情況

3 結(jié)論與討論

由于十字花科植物在進(jìn)行屬間、種間雜交時(shí)，其后代往往表現(xiàn)胚珠不育[5～11]，具體表現(xiàn)為莢果長到一定程度以后就會(huì)黃化，也就是雜種胚胎已經(jīng)開始敗育，本試驗(yàn)中也獲得類似的結(jié)果。造成胚胎敗育的原因可能有多種，但從目前有關(guān)的研究成果看，這些原因大致可歸納為7類：胚囊發(fā)育異常、胚乳發(fā)育異常、幼胚起源、營養(yǎng)供應(yīng)失調(diào)、內(nèi)源激素、酚類物質(zhì)、某些酶活及基因調(diào)控等方面，歸納起來它們大多有一個(gè)共同的特征，即這些胚較之親本產(chǎn)生了幅度過大的變異，導(dǎo)致胚自身生長不諧調(diào)而死亡、或者和親本不諧調(diào)而死亡[4，11～14]。 至于蘿卜和大頭菜雜種胚敗育的原因還有待進(jìn)一步研究。授粉以后莢果便開始生長，雜交后的初期結(jié)莢率在64%～88%，到第8天莢長停止增加，而橫徑第7天停止生長，授粉以后第7天開始敗育，而且越往后敗育得越快。在雜交莢發(fā)育到5～8 d，采用本試驗(yàn)的生芽和生根培養(yǎng)基能培育出成功的試管苗，而陳樹忠等[5]對(duì)甘藍(lán)型油菜和羽衣甘藍(lán)雜交子房培養(yǎng)的研究認(rèn)為，取授粉后第10天的子房培養(yǎng)獲得種子成功率較高，時(shí)間的差別說明不同物種胚胎搶救的最佳時(shí)間不一樣。

孟金陵[15]曾對(duì)蕓薹屬及近緣種屬植物遠(yuǎn)緣雜交不親和性問題作過比較全面的專門綜述，并對(duì)甘藍(lán)型油菜與近緣種屬植物遠(yuǎn)緣雜交時(shí)花粉雌蕊相互作用作了研究。這對(duì)于克服油菜與其近緣種屬植物遠(yuǎn)緣雜交不親和性障礙,提高雜種獲得率均具有理論和實(shí)際意義。胡大有等[11]認(rèn)為蘿卜與油菜的遠(yuǎn)緣雜交存在嚴(yán)重的生殖障礙，試驗(yàn)也遇到了雜交不親和的障礙，但采用重復(fù)授粉法可提高其親和性。目前關(guān)于蕓薹屬植物與蘿卜之間遠(yuǎn)緣雜交不親和性障礙的研究報(bào)道很少，且原因尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

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Intergeneric Hybrid Embryo in Vitro Culture ofRaphanus sativusL.andBrassica junceaCoss.var.napiformmisPal et.Bols

GAN Caixia,HE Yunqi,CUI Lei,MEI Xuefei,MEI Shiyong
(Hubei Provincial Academy of Agricultural Crops,Wuhan 430072)

A male sterile line DH303A ofRaphanus sativusL.as the female parent,crossed with a male line ofBrassica junceaCoss.var.napiformmisPal et.Bols.This was an intergeneric hybrid and their embryo had been developed in medium(1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5%activated carbon)and the rooting medium(1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.5%activated carbon)after the 5-7 days during budding.Seedlings could be obtained successfully through this procedure.

Raphanus sativusL.;Brassica junceaCoss.var.napiformmisPal et.Bols;Distant hybirdization;Embryo rescue;Hybrid embryos;Culture in vitro

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.08.006

國家科技支撐子課題十字花科及特種蔬菜優(yōu)異基因源挖掘與種質(zhì)創(chuàng)新利用研究（2006BAD13B06-4-4）

甘彩霞（1952-），女，碩士，助理研究員，E-mail：gancaixiazhuanye@126.com

梅時(shí)勇（1965-），男，通信作者，研究員，E-mail：hbvegbt@163.com

2010-11-26