霍亂弧菌檢測方法的研究進(jìn)展

沈小婷，趙雪濤

上海市徐匯區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200237

霍亂弧菌(Vibriocholerae)是烈性腸道傳染病霍亂的病原體，可導(dǎo)致感染者劇烈嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、失水乃至死亡?；魜y是一種流行廣泛的烈性傳染病，在世界范圍出現(xiàn)多次大流行，病死率甚高?；魜y弧菌的快速、準(zhǔn)確檢測是制定霍亂預(yù)防、控制政策的重要依據(jù)。國內(nèi)、外對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行了大量研究，建立了許多有效的檢測方法，其中傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)、生化檢測、血清學(xué)分型及噬菌體分型已廣泛應(yīng)用，并作為常規(guī)檢測手段。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)以其高敏感度、高特異度，操作簡便、迅速等優(yōu)點(diǎn)越來越多應(yīng)用于霍亂弧菌的檢測及分型研究。本文就近年來國內(nèi)、外對(duì)霍亂弧菌檢測方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 傳統(tǒng)檢測方法

霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌，營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，常以堿性蛋白胨水作為其選擇性增菌培養(yǎng)基?；魜y弧菌在堿性蛋白胨水中生長迅速，可將標(biāo)本在37 ℃培養(yǎng)6～8 h后取上層培養(yǎng)物做弧菌分離。霍亂弧菌在營養(yǎng)瓊脂和堿性瓊脂上呈無色、圓形、透明、光滑、濕潤、扁平或稍凸起、邊緣整齊的菌落。為便于檢出，根據(jù)其生長特性、對(duì)某些抗生素的敏感性及與其他常見腸道菌的差別，國內(nèi)已研制出慶大霉素瓊脂、四號(hào)瓊脂，國外有TCBS等選擇性培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基一般都含有膽鹽、亞碲酸鉀、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、慶大霉素、多黏菌素等抑菌劑。在不同的選擇性培養(yǎng)基上，霍亂弧菌具有不同的菌落特征。挑取可疑菌落后需進(jìn)行一系列生化反應(yīng)、血清凝集等試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合判定，從而確定為霍亂弧菌[1,2]。目前，細(xì)菌培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定仍是霍亂弧菌實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有較好的敏感度和特異度。但不可否認(rèn)，傳統(tǒng)方法檢測周期長、工作量大，且易受環(huán)境、培養(yǎng)條件及主觀因素影響，不能滿足疾病預(yù)防和控制快速反應(yīng)體系的需求，不利于實(shí)驗(yàn)室的快速診斷。

2 分子生物學(xué)方法

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)

2.1.1普通聚合酶鏈反應(yīng)運(yùn)用常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測霍亂弧菌，一般選擇霍亂腸毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因[3,4]。一些非產(chǎn)毒株(如環(huán)境來源的菌株)有可能通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得毒力基因成為產(chǎn)毒株，若僅檢測ctx基因容易造成漏檢。因此，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛A基因 (tcpA)、O抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達(dá)調(diào)控基因(toxR)等也被選用為PCR的靶基因[5,6]，這大大提高了檢測的特異度。PCR方法檢測霍亂弧菌的特異度和敏感度都很高，但其本身也有缺點(diǎn)：一是因樣本DNA交叉污染而出現(xiàn)假陽性；二是由于待測樣本中的某些雜質(zhì)蛋白及核酸提取過程中用到乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、SDS等，如未去除干凈就會(huì)成為TaqDNA聚合酶的抑制劑，造成擴(kuò)增失敗。此外，標(biāo)本中也可能含有會(huì)降解靶核酸的核酸酶，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，在運(yùn)用PCR檢測霍亂弧菌時(shí)，要注意避免DNA污染以及其他雜質(zhì)的干擾。

2.1.2多重PCR與常規(guī)PCR相比，多重PCR一次反應(yīng)可檢測多個(gè)基因，節(jié)省了時(shí)間和成本。國內(nèi)、外許多學(xué)者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、tcp與其他基因如ompW、rfb、hly進(jìn)行組合[7]，作為共同的靶基因，克服了由于毒力基因特異度不夠高而造成的假陽性。多重PCR同時(shí)可準(zhǔn)確區(qū)分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑒定其是否為產(chǎn)毒株，可謂一舉多得，大大提高了檢測效率。

Tarr等[8]運(yùn)用多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌的sodB、副溶血弧菌的flaE、創(chuàng)傷弧菌的hsp等基因，Gómez-Duarte等[9]運(yùn)用多重PCR從腹瀉患者的臨床標(biāo)本中同時(shí)檢測到包括霍亂弧菌在內(nèi)的7種腸道致病菌。這些都大大提高了感染性腹瀉病原學(xué)診斷的效率和水平，為多種致病菌的快速診斷提供了很好的思路和方法。多重PCR的引物設(shè)計(jì)要注意避免各對(duì)引物之間的相互干擾和各目的片段之間的非特異性擴(kuò)增。

2.1.3熒光定量PCR熒光定量PCR自動(dòng)化程度高、特異性強(qiáng)、無交叉污染，在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛應(yīng)用。尤其是近年來，隨著引物與探針的設(shè)計(jì)更精確、多通道熒光PCR儀的開發(fā)與廣泛使用，多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌等多種病原體的快速檢測，成為應(yīng)用的熱點(diǎn)。Huang等[10]選取O1和O139群特異的rbf基因以及ctxA、hylA等作為靶點(diǎn)，建立了四重?zé)晒舛縋CR體系，不僅克服了單重?zé)晒舛縋CR僅檢測毒力基因特異度不高而造成假陽性的缺點(diǎn)，而且能很好檢測并區(qū)分O1群和O139群霍亂弧菌及其毒力株，最低檢出限達(dá)每個(gè)反應(yīng)2個(gè)菌落形成單位(colony forming unit，CFU)。這與單重?zé)晒舛縋CR的最低檢出限相當(dāng)，降低了檢測成本，提高了檢測效率。Fykse等[11]運(yùn)用基于分子信號(hào)標(biāo)記的多重?zé)晒舛縋CR體系檢測環(huán)境標(biāo)本中霍亂弧菌的ctxA、tcpA、toxR、hlyA、groEL等多個(gè)基因的不同組合，在一定程度上削弱了標(biāo)本中雜質(zhì)的干擾，提高了PCR技術(shù)對(duì)環(huán)境標(biāo)本檢測的特異度，敏感度也較TaqMan探針和SYBR Green I方法提高了100倍。可見，多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)已成為未來檢測技術(shù)發(fā)展的趨勢，但必須保證不同探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光基團(tuán)間無相互干擾，且各目的片段有相近的擴(kuò)增效率。

2.2 基因芯片

與PCR方法相比，基因芯片技術(shù)能同時(shí)獲得更多病原學(xué)、生物學(xué)方面的信息，從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]運(yùn)用基因芯片技術(shù)對(duì)多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐藥基因及潛在的毒力基因進(jìn)行全面分析，對(duì)掌握這些細(xì)菌的致病性及進(jìn)行有效預(yù)防、控制等具有重要意義。但基因芯片成本較高，距離推廣應(yīng)用尚需時(shí)間等待。

2.3 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是2000年Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。此方法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件(60～65 ℃)孵育40～60 min，引發(fā)自動(dòng)鏈循環(huán)取代反應(yīng)，完成對(duì)靶基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物可通過電泳或直接通過副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進(jìn)行檢測。Yamazaki等[13]采用LAMP檢測霍亂弧菌的ctxA基因，最低檢測限達(dá)每個(gè)反應(yīng)1.4 CFU，比普通PCR高近10倍，說明該方法具有很高的靈敏度。

3 免疫學(xué)方法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)一般不需要分離即可直接對(duì)樣品進(jìn)行檢測，操作簡便。國內(nèi)、外已有許多學(xué)者制備了針對(duì)O1群、O139群霍亂弧菌的單克隆抗體，特異性檢測這2種細(xì)菌。Tuteja等[14]用含有ctxB和ompW片段的重組蛋白免疫小鼠，制備了分別針對(duì)這2種抗原的單克隆抗體；同時(shí)檢測并區(qū)分了臨床及環(huán)境標(biāo)本中霍亂弧菌的產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株，其檢出限達(dá)102CFU/ml，大大提高了此類方法的特異度和敏感度。

3.2 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)具有簡單、快捷、易于判讀結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，已有多種商品化的O1群、O139群霍亂弧菌快速檢測試紙條，廣泛應(yīng)用于該菌的臨床檢測。但其檢測靈敏度和特異度較差。Mukherjee等[15]應(yīng)用Dipstick Kit檢測O1群、O139群霍亂弧菌，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法比較，具有更高的靈敏度和特異度。

4 結(jié)語

采用分子生物學(xué)技術(shù)研究霍亂及其流行病學(xué)特征，可從分子水平闡明霍亂發(fā)生、發(fā)展、分布等規(guī)律，為霍亂弧菌的檢測和研究提供更多的思路和方法，逐漸成為未來檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。但有些新技術(shù)的應(yīng)用至今仍然存在一定障礙，如PCR技術(shù)本身的缺陷造成假陽性或假陰性結(jié)果，引物設(shè)計(jì)、操作技巧等也造成其應(yīng)用上的缺陷；再如基因芯片從研究走向臨床，關(guān)鍵的技術(shù)問題(簡化樣品制備和標(biāo)記技術(shù)、增強(qiáng)檢測信號(hào)靈敏度、提高芯片檢測特異度、芯片檢測全過程自動(dòng)化及降低檢測成本等)不可回避。應(yīng)將傳統(tǒng)的微生物檢測技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于病原微生物的檢測和研究，尤其是當(dāng)發(fā)現(xiàn)未知病原體時(shí)，需借助微生物學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法確定病原體，只有這樣才能真正提高病原微生物的檢測和研究能力。

[1] 聞?dòng)衩?現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M].上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1999：331-334.

[2] 王秀茹.預(yù)防醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002: 338-339.

[3] Shirai H, Nishibuchi M, Ramamurthy T, Bhattacharya SK, Pal SC, Takeda Y. Polymerase chain reaction for detection of the cholera enterotoxin operon of Vbrio cholerae [J]. J Clin Microbiol, 1991, 29(11): 2517-2521.

[4] Ramamurthy T, Pal A, Bag PK, Bhattacharya SK, Nair GB, Kurozano H, Yamasaki S, Shira H, Takeda T, Uesaka Y. Detection of cholera toxin gene in stool specimens by polymerase chain reaction: comparison with bead enzyme-linked immunosorbent assay and culture method for laboratory diagnosis of cholera [J]. J Clin Microbiol, 1993, 31(11): 3068-3070.

[5] Chen CH, Shimada T, Elhadi N. Radu S, Nishibuchi M. Phenotypic and genotypic characteristic and epidemiological significance of ctx+strains of Vibrio cholerae isolated from seafood in Malaysia [J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(4): 1964-1972.

[6] Nandi B, Nandy RK, Mukhopadhyay S, Nair GB, Shimada T, Ghose AC. Rapid method for species-specific identification of Vibrio cholerae using primers targeted to the gene of outer membrane protein OmpW [J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(11): 4145-4151.

[7] Teh CSJ, Thong KL, Ngoi ST, Ahmad N, Nair GB, Ramamurthy T. Molecular characterization of serogrouping and virulence genes of Malaysian Vibrio cholerae isolated from different sources [J]. J Gen Appl Microbiol, 2009, 55(6): 419-425.

[8] Tarr CL, Patel JS, Puhr ND, Sowers EG, Bopp CA, Strockbine NA. Identification of vibrio isolates by a multiplex PCR assay and ropB sequence determination [J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(1): 134-140.

[9] Gómez-Duarte OG, Bai J, Newell E. Detection of E. coli, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, and Campylobacter spp. enteropathogens by three-reaction multiplex PCR [J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2009, 63(1): 1-9.

[10] Huang J, Zhu Y, Wen H, Zhang J, Huang S, Niu J, Li Q. Quadruplex real-time PCR assay for detection and identification of Vibrio cholerae O1 and O139 strains and determination of their toxigenic potential [J]. Appl Environ Microbiol, 2009, 75(22): 6981-6985.

[11] Fykse EM, Skogan G, Davies W, Olsen JS, Blatny JM, Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequence-based amplification [J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(5): 1457-1466.

[12] Vora GJ, Meador CE, Bird MM, Bopp CA, Andreadis JD, Stenger DA. Microarray-based detection of genetic heterogeneity,antimicrobial resistance, and the viable but nonculturable state in human pathogenic Vibrio spp. [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(52): 19109-19114.

[13] Yamazaki W, Seto K, Taguchi M, Ishibashi M, Inoue K. Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using a loop-mediated isothermal amplification [J]. BMC Microbiol, 2008, 8(94): 1-7.

[14] Tuteja U, Kumar S, Shukla J, Kingston J, Batra HV. Simultaneous direct detection of toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae from rectal swabs and environmental samples by sandwich ELISA [J]. J Med Microbiol, 2007, 56 (Pt 10): 1340-1345.

[15] Mukherjee P, Ghosh S, Ramamurthy T, Bhattacharya MK, Nandy RK, Takeda Y, Nair GB, Mukhopadhyay AK. Evaluation of a rapid immunochromatographic dipstick kit for diagnosis of cholera emphasizes its outbreak utility [J]. J Infect Dis, 2010, 63 (4): 234-238.