依托泊苷聚乳酸微球的制備

姜素芳，張?jiān)评?，周學(xué)軍

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410013）

依托泊苷是目前常用的抗腫瘤藥物之一，具有廣譜抗癌活性和相當(dāng)高的治療指數(shù)，尤其對(duì)早期擴(kuò)散的小細(xì)胞肺癌效果良好[1,2]，其主要毒性為骨髓抑制、消化道毒性及嗜中性白細(xì)胞的嚴(yán)重減少[3]，本實(shí)驗(yàn)旨在以生物降解性高分子材料聚乳酸為載體,制備依托泊苷聚乳酸微球，通過(guò)控制其粒徑大小，使其靜脈注射后能濃集于肺組織，緩慢釋放依托泊苷，從而降低全身藥物濃度，減少全身毒副作用。

1 儀器與試劑

FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī) (上海標(biāo)本模型廠)；78Hw-1型恒溫磁力攪拌器 (江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；TG16G臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；生物顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；依托泊苷(中南大學(xué)藥學(xué)院提供)；聚乳酸 [PLA分子量30000](山東醫(yī)療器械研究所)；明膠(上?；瘜W(xué)試劑公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 依托泊苷的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取依托泊苷50 mg，置50 mL容量瓶，用氯仿溶解、定容，作為儲(chǔ)備液。分別取儲(chǔ)備液1,2,3,4,5 mL于50 mL容量瓶中，加氯仿定容，用紫外分光光度法在285 nm波長(zhǎng)下測(cè)各標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值A(chǔ)，將相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。A=6.854C-0.008979(mg/mL)，r=0.9999，說(shuō)明依托泊苷溶液在20～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取依托泊苷及空白微球適量于50 mL量瓶中氯仿溶解并定容，分別吸取1,2,5mL于50 mL容量瓶中，氯仿定容，在285 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算回收率。結(jié)果高、中、低濃度平均回收率分別為99.6%，98.1%，98.4%。

2.2 微球載藥量和包封率的測(cè)定

精密稱取依托泊苷聚乳酸微球30 mg于50 mL量瓶中，加入氯仿超聲溶解并定容，過(guò)濾并測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藥物濃度，按下式計(jì)算微球載藥量和包封率。

2.3 依托泊苷聚乳酸微球的制備

采用乳化-溶劑擴(kuò)散法制備。將依托泊苷和聚乳酸溶于有機(jī)溶媒中，攪拌使其溶解作為油相；在一定的攪拌速度下用注射器將油相緩慢注入分散介質(zhì)中，攪拌乳化一定時(shí)間，再把其傾入到大量的蒸餾水中，攪拌一定時(shí)間，離心收集微球，常壓干燥即得。

經(jīng)單因素考察，確定有機(jī)溶媒為二氯甲烷、分散介質(zhì)為明膠水溶液、O/W比例為5/40，攪拌速度為1200 r/min時(shí)，微球形態(tài)好，成球率高，粒徑大小適宜且不粘連。固定以上條件，選擇對(duì)微球包封率和載藥量影響較顯著的三個(gè)因素即明膠濃度、PLA濃度以及投藥比VP/PLA進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素確定三個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化制備處方和工藝。因素水平見(jiàn)表1、結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交因素水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由極差分析可知，最佳實(shí)驗(yàn)方案為A1B2C3，即分散介質(zhì)明膠的濃度為1%(w/v)，投藥比(依托泊苷：聚乳酸)為1:3(w/w)，有機(jī)相中聚乳酸濃度為5%(w/ v)。在此優(yōu)化條件下制備3批依托泊苷微球，測(cè)得藥物包封率和載藥量見(jiàn)表3。

表3 三批樣品的載藥量和包封率

2.4 依托泊苷聚乳酸微球的形態(tài)和粒徑

將依托泊苷聚乳酸微球均勻分散于載玻片上，使用帶測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡記錄500個(gè)微球的粒徑，粒徑分布情況見(jiàn)圖1，平均粒徑為12.87μm。微球外觀圓整，大小均勻，無(wú)粘連。見(jiàn)圖2。

圖1 微球粒徑分布圖

圖2 光學(xué)顯微鏡下微球照片

2.5 依托泊苷聚乳酸微球的體外釋藥特性

采用動(dòng)態(tài)滲析法[4]：精密稱取依托泊苷聚乳酸微球250 mg置于透析袋內(nèi)，加pH 7.4磷酸緩沖液5 mL封口，裝入水浴恒溫振蕩儀中，以250 mL pH 7.4磷酸緩沖液作釋放介質(zhì)，(37±0.1)℃恒溫釋放，定時(shí)吸取介質(zhì)3 mL，加氯仿6 mL混合，離心，在285 nm處測(cè)吸光度，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算累積釋放百分率(Q)。釋藥曲線見(jiàn)圖3。

經(jīng)擬合，釋藥曲線符合Higuchi方程：Q=4.721 t1/2+15.00，r=0.9903,10d累積釋藥量約85%，T1/2為55.0h，說(shuō)明所得依托泊苷聚乳酸微球具有明顯的緩釋作用，最初5 h微球釋藥達(dá)21%，說(shuō)明有一定的突釋，之后逐漸變?yōu)榫忈屵^(guò)程，釋藥符合長(zhǎng)效制劑的特征。

3 討論

依托泊苷是一種脂溶性藥物,在水中幾乎不溶,因此非常適于用O/W乳化法制備載藥微球,其中乳化劑的選擇對(duì)微球的形成影響較大[5]。實(shí)驗(yàn)中曾嘗試采用PVA作乳化劑，結(jié)果制得的乳劑不穩(wěn)定，易聚集，所得微球粘結(jié)，后改用明膠作為乳化劑，獲得穩(wěn)定、圓整均勻的微球。原因可能是PVA親水性較強(qiáng)，水溶液粘度不夠大，不能形成穩(wěn)定的o/w型乳滴，而明膠水溶液粘度較高,乳化能力更強(qiáng)，可在體系中形成牢固的界面膜獲得穩(wěn)定乳劑從而避免微球粘結(jié)。

作為肺靶向藥物，關(guān)鍵是控制微球的粒徑，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)粒徑在10～20μm的微球靜脈注射后可被肺部機(jī)械截留從而提高肺部藥物的濃度[6]。本試驗(yàn)通過(guò)調(diào)節(jié)O/W比例、乳化時(shí)攪拌速度、聚乳酸的濃度、乳化時(shí)油相加入的方式和速度等因素，獲得粒徑符合要求、光滑圓整不粘結(jié)的微球，進(jìn)而再采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳處方工藝，進(jìn)一步提高了微球的包封率和載藥率。制得的依托泊苷微球體外釋藥曲線符合Higuichi方程，具有明顯的緩釋特征，但關(guān)于其體內(nèi)的釋藥和靶向性能還有待于進(jìn)一步研究。

[1]Stahelin HF,von Warturg A.The chemical and biological route from podophyllotoxin glucoside to etoposide[J].Cancer Res,1991,51(1):5-15.

[2]Joseph Aisner MD,Edward J.Lee MD.Etoposide:Current and future status[J].Cancer,1991,67(Suppl 1):215-219.

[3]劉瑞林,李濱,楊銘,等.高效液相色譜法檢測(cè)人血漿中的依托泊甙[J].藥物分析雜志,1994,14(5):40.

[4]張志清,楊秀嶺,孫莉,等.依托泊苷白蛋白微球的制備[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2000,35(3):171.

[5]王哲,倪宏哲,張明耀,等.聚乳酸微球制備工藝的研究[J].高分子材料科學(xué)與工程,2007,23(6):207-210.

[6]Huo D,Deng S,Li L,et al.Studies on the poly(lactic-coglycolic)acid microspheres of cisplatin for lung-targeting [J].Int J Pharm,2005,289(1-2):63-67.