米曲霉HDF-7蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

于艷穎,董海莉,平文祥,葛菁萍

(黑龍江大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院;b.微生物黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150080)

0 引 言

豆醬是我國四大傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品之一,含有人體所需的多種營養(yǎng)成分,具有許多獨(dú)特的生理調(diào)節(jié)功能,如抑制膽固醇、抗癌作用[1]、降血壓[2]、溶解血栓、抗氧化性,此外豆醬還被認(rèn)為具有防止胃潰瘍的功效[3]。人們還期望豆醬作為促進(jìn)分泌胰島素的食品,起到預(yù)防和改善糖尿病癥和抑制癌細(xì)胞增殖的效果[4]。

豆醬的發(fā)酵主要依賴米曲霉所產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶的作用。研究發(fā)現(xiàn),米曲霉分泌的蛋白酶主要以中性蛋白酶和堿性蛋白酶為主[5],特別是堿性蛋白酶的含量占40%～60%,蛋白酶能將豆醬中的大豆蛋白質(zhì)水解成低分子蛋白胨、朊、多肽及氨基酸,使其成為營養(yǎng)豐富、含有鮮味的調(diào)味品[6]。本課題組從農(nóng)家自釀豆醬中分離得到一株蛋白酶活力較高的米曲霉菌株HDF-7。本文報(bào)道了該米曲霉蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1 材料和方法

1.1 菌株

米曲霉HDF-7(由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從豆醬中分離并保存)。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖10 g,大豆蛋白胨5 g,麥芽浸膏3 g,酵母提取物3 g,蒸餾水1 000 mL,pH值自然, 121℃滅菌20 min[7]。

1.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對菌體產(chǎn)酶的影響

制備單孢子懸液,1%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基, 28℃180 r/min搖床培養(yǎng)。每24 h取1次樣,過濾獲得粗酶液,測定其酶活力。繪制時(shí)間-蛋白酶活力曲線(圖1),以確定最佳產(chǎn)酶時(shí)間。

1.4 分析方法[8]

蛋白酶的活力測定(Folin法):在40℃下1 min水解干酪素產(chǎn)生1 μ g酪氨酸,定義為一個(gè)蛋白酶活力單位。

蛋白質(zhì)濃度的測定:Braford法。

1.5 蛋白酶的分離純化

1.5.1 (NH4)2SO4鹽析曲線的制備

分別在10 mL粗酶液中緩慢逐步加入不同重量的固體硫酸銨,使其飽和度分別達(dá)到 0%, 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%, 80%(W/V)。邊加邊混勻,不得劇烈攪拌,避免產(chǎn)生氣泡,直至硫酸銨完全溶解,置于4℃冰箱24 h。4℃,10 000 r/min離心20 min,測定上清的剩余酶活力,確定硫酸銨沉淀蛋白酶的最適飽和度。

1.5.2 Sephadex G-50層析

將鹽析沉淀溶解于0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.2),過濾去除不溶物。采用Sephadex G-50層析除鹽,柱床規(guī)格為 Φ 1.6×20 cm,先用0.05 mol/L T ris-HCl緩沖液 (pH7.2)平衡至流出液恒定在pH7.2。上樣量為5 mL,用 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液 (pH7.2)洗脫,洗脫流量控制在2 mL/min。檢測洗脫液的蛋白質(zhì)濃度和酶活力,收集酶活力峰。

1.6 電泳分析[9]

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳條件:分離膠12%,濃縮膠4%,電泳電壓恒定為160 V。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.7.1 反應(yīng)最適溫度

在不同的溫度下 (30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃,60℃,65℃)測定蛋白酶活力,將最高的酶活力定義為100%,計(jì)算不同溫度條件下蛋白酶的相對酶活。

1.7.2 反應(yīng)最適pH值

不同pH值條件下 (pH值為3、4、5、6、7、8、9、10)進(jìn)行反應(yīng),測定蛋白酶活力,將最高的酶活力定義為100%,計(jì)算不同pH值條件下蛋白酶的相對酶活。

1.7.3 熱穩(wěn)定性

將酶液分別置于不同的溫度條件下 (20℃, 30℃,40℃,50℃,60℃)保溫不同的時(shí)間 (0 min,20 min,40 min,60 min,80 min,100 min,120 min)后,立即在0℃冰浴中冷卻,然后在40℃下測酶活,將最高的酶活力定義為100%,分別計(jì)算不同溫度條件下蛋白酶的剩余酶活與最高酶活的比值。

1.7.4 pH穩(wěn)定性

將酶液分別在不同pH值的緩沖液(pH3.0～10.0)中稀釋,40℃保溫2 h后,將體系的pH值調(diào)整至酶反應(yīng)的最適pH值,測定剩余的酶活力,將最高的酶活力定義為100%,分別計(jì)算不同pH值條件下蛋白酶的剩余酶活與最高酶活的比值。

1.7.5 各種金屬離子、NH+4對蛋白酶活力的影響

在蛋白酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)體系中,分別加入不同的金屬離子 (Li+,Na+,Mg2+,Al3+,K+, Ca2+,Fe2+,Fe3+,Mn2+,Zn2+,Cu2+,Ag+)、NH+4,并使其離子的最終濃度為0.01 mol/L,以不加金屬離子的反應(yīng)體系中的酶活力定義為100%,分別測定加入金屬離子后各反應(yīng)體系中蛋白酶的相對酶活。

1.7.6 酪蛋白濃度對蛋白酶水解速度的影響-Km的測定

以不同濃度的酪蛋白為底物,與提取的蛋白酶反應(yīng),在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定酶活力。酪蛋白濃度依次為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL,以濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)作Lineweaver -Burk圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對菌體產(chǎn)酶的影響

將米曲霉接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,于不同時(shí)間取樣測定蛋白酶活性。結(jié)果見圖1。該菌在培養(yǎng)1～2 d蛋白酶活性沒有明顯變化,之后酶活急劇升高,在3～4 d酶活達(dá)到最高峰并保持相對穩(wěn)定,在培養(yǎng)4 d后,隨著底物含量的減少,蛋白酶活性也逐漸降低。據(jù)此確定最佳的培養(yǎng)時(shí)間為3 d。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of different incubation time on Aspergillus oryzae protease activity

2.2 (NH4)2SO4鹽析飽和度的確定

鹽析法的優(yōu)點(diǎn)是在常溫沉淀過程中不會(huì)造成酶的失活,沉淀物在室溫下長時(shí)間放置也不易失活。(NH4)2SO4是較為常用的鹽析劑,溶解的溫度系數(shù)小,在較低溫度下其溶解度較高,濃度高時(shí)也不易引起蛋白質(zhì)生物活性的喪失。(NH4)2SO4沉蛋白酶的鹽析曲線見圖2。由圖2可見,(NH4)2SO4沉淀蛋白酶的飽和度應(yīng)為70%。

2.3 Sephadex G-50層析

圖2 硫酸銨鹽析曲線Fig.2 Ammonium sulfate salting-out curve

Sephadex G-50的分離范圍是1 000～30 000 Da,主要用于肽類分離、脫鹽和分子量鑒定。鹽析沉淀復(fù)溶于緩沖液中,經(jīng)過Sephadex G-50凝膠層析得到洗脫峰1和2(圖3),根據(jù)凝膠過濾的原理,大分子先出來,小分子后出來,可以斷定洗脫峰1的分子量大于洗脫峰2的分子量,分別收集洗脫峰1和2,測定酶活,發(fā)現(xiàn)酶活主要集中在洗脫峰1上。保留洗脫峰1的收集液,留待下一步檢測純度并鑒定分子量。

圖3 Sephadex G-50洗脫圖譜Fig.3 Sephadex G-50 molecular sieve chromatography

2.4 蛋白酶純化總過程

30 mL粗酶液經(jīng)70%飽和 (NH4)2SO4沉淀,結(jié)果酶的比活力為127.56 U/mg,純化了1.08倍,回收率55.29%,說明在沉淀的過程中蛋白酶會(huì)有一定的損失,再經(jīng)過Sephadex G-50凝膠過濾層析后,比活力為343.04 U/mg,被純化了2.89倍,活力回收率為5.13%。整個(gè)純化過程見表1。

2.5 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

將純化后的蛋白酶進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)染色脫色后,得到圖4。如圖4所示,泳道M是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),泳道1是已純化的蛋白酶,得到單一條帶,說明該蛋白酶已經(jīng)達(dá)到電泳純,并且推測該蛋白酶的相對分子質(zhì)量約為 30 KDa。

表1 純化過程總表Table 1 Purification of protease from Aspergillus oryzae

圖4 SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE pattern of the purified protease from Aspergillus oryzae

2.6 蛋白酶的最適反應(yīng)溫度

在其他因素不變的情況下,在不同的溫度下將純化的蛋白酶和底物反應(yīng)10 min,檢測蛋白酶活性,結(jié)果見圖5。由圖5可見,該蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為50℃,此時(shí)酶的催化反應(yīng)活性最高。30℃時(shí)酶的活性受低溫的抑制,不能充分發(fā)揮酶的活性;60℃及以上的溫度時(shí),溫度過高使酶變性失活造成酶的活性下降。文獻(xiàn) [10]報(bào)道,米曲霉在50℃時(shí)水解酪蛋白的速率是最快的。

圖5 反應(yīng)溫度對蛋白酶活性的影響Fig.5 Effects of reaction temperature on the protease activity

2.7 蛋白酶的熱穩(wěn)定性

將酶液在不同的溫度下分別保溫不同的時(shí)間后,立即冰浴冷卻,然后再與底物進(jìn)行酶反應(yīng),測定酶活,以剩余的酶活性作為評價(jià)酶的熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。結(jié)果見圖6。該蛋白酶在20℃下相對穩(wěn)定, 30℃處理40 min后,酶活力仍保持66.7%;40℃處理20 min后,酶活力保持59.92%;50℃處理20 min后,酶活力保持了52.67%;60℃處理20 min后,酶活力只保持了45.43%。與米曲霉M3[11]所產(chǎn)蛋白酶相比,該蛋白酶不耐熱,酶活下降較慢,但是其穩(wěn)定性仍不如今野曲霉[12]。

圖6 蛋白酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of protease

2.8 蛋白酶的最適反應(yīng)pH

在其他因素不變的情況下,不同的pH值緩沖液進(jìn)行酶與底物的反應(yīng),檢測酶活性,圖7表明, pH3～5時(shí),酶活只有60%～70%,隨著 pH增大,酶活逐漸提高,pH7.0時(shí)酶活最高,之后隨著pH增大,酶活顯著降低,pH10時(shí)酶活只有48.92%。說明該蛋白酶的最適反應(yīng)pH值為7.0,在酸性或堿性條件下酶活均較低,說明該蛋白酶屬于中性蛋白酶。

圖7 pH值對蛋白酶活性的影響Fig.7 Effects of reaction pH on the protease activity

2.9 蛋白酶的pH穩(wěn)定性

在其他因素不變的情況下,分別取用不同pH的緩沖液稀釋的酶液置于40℃恒溫水浴中保溫2 h后,用pH值為7.0的緩沖液適當(dāng)稀釋,使其終體積均相等,pH均為7.0,再進(jìn)行酶反應(yīng),測定其剩余酶活,將最高的酶活力定義為100%,分別計(jì)算不同溫度條件下蛋白酶的剩余酶活與最高酶活的比值。結(jié)果如圖8,該蛋白酶在pH3.0～6.0時(shí)剩余酶活逐漸上升,在pH6.0～8.0時(shí)相對穩(wěn)定, pH 7.0時(shí)酶活最高,pH8.0～10.0時(shí)酶活緩緩下降。說明該蛋白酶適宜在中性條件下保存。該蛋白酶pH穩(wěn)定性與米曲霉M3相當(dāng),比米曲霉311、滬釀3.042、今野曲霉[13]穩(wěn)定范圍要寬。

圖8 蛋白酶的pH穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of the protease

2.10 某些金屬離子、NH+4對酶活性的影響

在其他因素不變的情況下,在酶液中加入各種金屬離子和NH+4使其濃度均達(dá)0.01 mol/L,以不加金屬離子的酶活為100%,測定其相對酶活。結(jié)果見圖9。Ca2+,Mn2+,Zn2+對該蛋白酶有激活作用,其中Mn2+的激活作用最明顯;NH+4,K+, Ag+對酶活影響不大;Li+,Na+,Mg2+,Al3+, Fe2+,Fe3+,Cu2+對該蛋白酶有抑制作用,其中Cu2+的抑制作用最明顯。Ca2+,Zn2+對大多數(shù)中性蛋白酶都有激活作用,Ca2+常被添加在培養(yǎng)基中促進(jìn)蛋白酶的產(chǎn)生[14]。

圖9 各種金屬離子、NH4+對蛋白酶活性的影響Fig.9 Effect of metal ions and NH4+on protease activity

2.11 酪蛋白濃度對蛋白酶水解速度的影響-Km的測定

以不同濃度的酪蛋白為底物,與純化的蛋白酶反應(yīng),其他因素不變,測定酶活力。以濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)作圖,見圖 10。以酪蛋白為底物時(shí),Km值為78 μ g/mL,最大反應(yīng)速度Vmax為6.29 μ g/min,米氏常數(shù)數(shù)值等于酶促反應(yīng)最大速度的1/2時(shí)所需的底物濃度。它表示酶和底物之間的親和能力,Km值越大,說明需要更多的底物才能達(dá)到最大反應(yīng)速度的1/2,即酶的親和能力越弱,反之亦然。該酶的米氏常數(shù)較小,說明其對酪蛋白的親和力較強(qiáng)。

圖10 蛋白酶的Lineweaver-Burk圖Fig.10 Lineweaver-Burk's plot of protease

3 結(jié) 論

試驗(yàn)就米曲霉菌種HDF-7所產(chǎn)蛋白酶的分離純化及部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明該米曲霉所產(chǎn)蛋白酶硫酸銨沉淀的最佳飽和度為70%,經(jīng)硫酸銨沉淀和凝膠過濾層析得到電泳純的蛋白酶,經(jīng)SDS-PAGE電泳測定其相對分子質(zhì)量約為30 KDa。最適作用溫度為50℃,最適 pH值為7.0;20℃下酶穩(wěn)定性較好,60℃下處理20 min,酶活減少到1/2以下,說明該酶不耐熱,不宜長時(shí)間在室溫下存放;其pH為6.0～8.0。以酪蛋白為底物時(shí),Km值為 78 μ g/mL,最大反應(yīng)速度Vmax=6.29 μ g/min。Ca2+,Mn2+,Zn2+對該蛋白酶有激活作用,其中Mn2+的激活作用最明顯; NH+4,K+,Ag+對酶活影響不大;Li+,Na+, Mg2+,Al3+,Fe2+,Fe3+,Cu2+對該蛋白酶有抑制作用,其中Cu2+的抑制作用最明顯。

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