P-選擇素在糖尿病中的研究進(jìn)展＊

顧慧群綜述 王偉靈審校

P-選擇素在糖尿病中的研究進(jìn)展＊

顧慧群綜述 王偉靈審校

本文2011—02—28收到，2011—03—11修回，2010—03—18接受

細(xì)胞黏附分子選擇素家族的重要成員P-選擇素（P-se-lectin），儲(chǔ)存于靜止血小板的α顆粒和血管內(nèi)皮細(xì)胞棒管狀小體內(nèi)。當(dāng)血栓形成或炎癥刺激致血小板活化時(shí)，其顆粒膜與胞質(zhì)膜融合，通過胞吐作用，P-選擇素迅速暴露于血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表面，在炎癥反應(yīng)和血栓形成初期起主要作用。高血糖是糖尿病微血管病變的病理學(xué)基礎(chǔ)之一。高血糖引起血紅蛋白糖基化，使組織缺氧和脂肪代謝紊亂，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血小板活化，使P—選擇素表達(dá)增加。P-選擇素水平檢測作為糖尿病患者血栓形成風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因子，在臨床防治過程中起到一定的作用，因而得到較多應(yīng)用。本文就P-選擇素的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)效應(yīng)和實(shí)驗(yàn)室檢測以及在糖尿病、糖尿病心臟病中的作用作一綜述。

1 P-選擇素的生物學(xué)效應(yīng)

1.1 P-選擇素的結(jié)構(gòu)及作用

P-選擇素又稱α顆粒膜蛋白140，依賴血小板激活的顆粒外膜即CD62p，是高度糖基化的單鏈跨膜糖蛋白。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是氨基端有約120個(gè)氨基酸的凝集素樣區(qū)，以及約40個(gè)氨基酸的表皮生長因子（EGF）樣區(qū)和九個(gè)相似的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（Complement Regulatory Protein，CRP）串聯(lián)重復(fù)序列。P-選擇素的凝集素樣區(qū)，可識(shí)別配基中唾液酸化的氨基多糖結(jié)構(gòu)Lewisx，表達(dá)唾液酸化的Lewisx的細(xì)胞均可以與P—選擇素結(jié)合。因此測定血漿P-選擇素濃度可以評估體內(nèi)血小板活化及內(nèi)皮損傷程度［1］。

P-選擇素屬于選擇素家族，在人和小鼠位于1號(hào)染色體，組成一個(gè)基因決定簇。選擇素主要包括P—選擇素、E-選擇素、L-選擇素，由胞外區(qū)的凝集素、表皮生長因子、CRP重復(fù)序列以及跨膜區(qū)與胞質(zhì)區(qū)組成，P、E、L-選擇素是根據(jù)CRP重復(fù)序列的不同進(jìn)行分類的。新合成的P-選擇素首先儲(chǔ)存在Weibel-Palade小體，在炎癥介質(zhì)如組胺、凝血酶等刺激下，通過胞質(zhì)膜融合釋放，形成P-選擇素在細(xì)胞表面的再分配。高表達(dá)的P-選擇素可通過P-選擇素糖蛋白配體l（PSGL-1）介導(dǎo)血小板、內(nèi)皮細(xì)胞及白細(xì)胞間的細(xì)胞初始黏附以及白細(xì)胞沿血管壁內(nèi)皮滾動(dòng)，啟動(dòng)和促進(jìn)血栓形成及局部白細(xì)胞黏附聚集［2，3］。

P—選擇素可以直接興奮中性粒細(xì)胞，也可增強(qiáng)血小板活化因子（PAF）和其它激動(dòng)劑興奮中性粒細(xì)胞的能力，如將外周血中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞與血小板共孵育可產(chǎn)生超氧負(fù)離子，超氧負(fù)離子的產(chǎn)生量依賴于共孵育的時(shí)間和血小板濃度；激活的血小板增強(qiáng)白細(xì)胞超氧負(fù)離子的作用可以被P—選擇素抗體、抗Sialyl-1ewisx抗體或可溶性重組P—選擇素融合蛋白抑制［4］。

P-選擇素可以促進(jìn)白細(xì)胞的游走［3］。白細(xì)胞上有P-選擇素最重要的配體PSGL-l，PSGL-1是一個(gè)同型二聚體，每個(gè)亞基的分子量為120 k D，表達(dá)在各種類型的白細(xì)胞上。P—選擇素與PSGL-1相互作用，形成血小板—白細(xì)胞聚集體，后者對血液凝固和炎癥過程起非常重要的作用。

P-選擇素還可以調(diào)節(jié)血小板的游走和CD40L（腫瘤壞死因子家族成員）的表達(dá)。血小板CD40L的表達(dá)增加及血漿可溶性CD40L受體升高都具有促血栓形成作用，CD40L與細(xì)胞膜上的CD40L受體結(jié)合可促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子、白介素（IL-2、IL-8）、單核細(xì)胞趨化蛋白、組織因子（TF）的合成增加，并且上調(diào)黏附因子的表達(dá)［6］，從而促進(jìn)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，是心血管事件的危險(xiǎn)因素。

P-選擇素還可以穩(wěn)定血小板聚集物，并且決定血小板聚集物的體積，在止血和血栓形成中起到非常重要的作用［7］。

1.2 P-選擇素的檢測

1.2.1 ELLSA：P-選擇素有兩種變型，即可溶性 P—選擇素和膜P-選擇素?？扇苄訮-選擇素在血液中以單體的形式存在于血漿或血清中。檢測標(biāo)本宜置于—80℃保存，避免反復(fù)凍融。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心ABC-ELlSA法測定，即用純化的人P-選擇素抗體包被微孔板，制成固相抗體，與待測標(biāo)本中的P-選擇素結(jié)合，再與HRP標(biāo)記的P-選擇素抗體結(jié)合，形成抗體—抗原—酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色，TMB在HRP的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品中的P—選擇素濃度呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品P-選擇素濃度。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）：利用流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜上P-選擇素的含量是公認(rèn)的判定血小板活化狀態(tài)的 “金標(biāo)準(zhǔn)”［8］。流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜上活化標(biāo)記物P-選擇素（CD62p）的優(yōu)點(diǎn)為：直接應(yīng)用全血檢測，可反映血小板生理狀態(tài)下的功能，同時(shí)簡化了標(biāo)本的處理，最大限度地減少了人為活化血小板，避免了因離心導(dǎo)致的血小板體外激活，并防止血小板亞群的丟失；且標(biāo)本用量少，尤其適用于兒童和血小板減少癥患者；還能檢測出少到1%的活化血小板亞群及單個(gè)或亞群血小板膜活化標(biāo)志物。其不足之處是價(jià)格較昂貴，操作復(fù)雜。

1.2.3 時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）：其原理是將三價(jià)稀土離子（如Eu3＋）作為示蹤物，通過這些稀土離子與具有雙功能結(jié)構(gòu)的螯合劑以及抗原形成稀土離子—螯合劑—抗原螯合物。當(dāng)標(biāo)記抗原、待測抗原共同競爭抗體，形成免疫復(fù)合物時(shí)，利用時(shí)間分辨熒光分析儀，即可測定復(fù)合物中稀土離子發(fā)射的熒光強(qiáng)度，從而確定待測抗原的量。TRF1A克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素帶來的污染問題，也克服了酶免疫分析法（EIA）中酶的不穩(wěn)定性缺點(diǎn)，并且能夠很好的消除背景熒光的干擾，使其靈敏度比普通熒光法（FIA）高出幾個(gè)數(shù)量級。

朱瑩瑩等［9］對以上3種方法進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，用FCM、ELISA及TRFIA的結(jié)果是相聯(lián)系的、一致的。ELISA儀器價(jià)格便宜，適合在基層單位應(yīng)用；TRFIA的靈敏度高，操作方便，但儀器價(jià)格較貴；FCM用血量少，勿需分離血漿，檢測速度快，只是批間差異較大，儀器價(jià)格較貴。以上3種方法尚需進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化。

2 P-選擇素在糖尿病中的作用

糖尿病患者微血管病變和大、中血管病變的發(fā)生率較高。微血管病變主要是視網(wǎng)膜眼底病變、腎臟病變、肢體末端壞疽等。大、中血管病變主要為動(dòng)脈粥樣硬化，多累及心、腦血管，引起冠心病和腦血管意外。長期高血糖引起血紅蛋白的糖基化，使組織缺氧和脂肪代謝紊亂，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血小板活化，增加血小板P-選擇素表達(dá)，促進(jìn)血小板聚集。

2.1 P-選擇素與糖尿病微血管病變

長期高血糖可導(dǎo)致糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)P—選擇素及增強(qiáng)白細(xì)胞黏附，而胰島素能明顯抑制P—選擇素表達(dá)及其介導(dǎo)的白細(xì)胞黏附，因此推測糖尿病微血管病變與P-選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附、血栓形成及促進(jìn)炎癥有關(guān)［10］。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的血小板活化在無腎臟微血管病變時(shí)已經(jīng)存在，只不過在發(fā)生了腎臟微血管病變后血小板活化更加明顯，且釋放出大量P—選擇素，參與微血管病變的過程，而不是微血管病變的結(jié)果［11］。

糖尿病視網(wǎng)膜病變與微血管的損害和毛細(xì)血管堵塞有關(guān)，血小板以及單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞可能參與堵塞毛細(xì)血管，因在糖尿病患者的視網(wǎng)膜和腎臟的毛細(xì)血管中發(fā)現(xiàn)有血小板聚集物和血栓形成；近年研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者視網(wǎng)膜血管中可溶性P-選擇素水平增加［12］。

糖尿病腎病（DN）是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者的重要死亡原因之一。王鋒等［10］研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血漿P—選擇素的水平高于正常組，而DN患者的P—選擇素水平明顯高于無并發(fā)癥的糖尿病患者，表明P—選擇素水平對判斷DN的發(fā)生和發(fā)展有一定價(jià)值。Omoto等［13］研究也證明，DN外周血P—選擇素陽性者，血小板數(shù)量比正常對照組及無并發(fā)癥糖尿病組明顯升高，在給予抗血小板藥物后，P-選擇素陽性患者的血小板計(jì)數(shù)水平顯著下降。此外Hirata等［14］發(fā)現(xiàn)，DN患者腎組織中P-選擇素沿著腎小球、間質(zhì)毛細(xì)血管分布，與其它腎病（如微小病變性腎病、Ig A腎病及狼瘡性腎炎等）相比，其表達(dá)顯著增加。表明P-選擇素的高度表達(dá)與腎小球硬化、間質(zhì)纖維化有密切關(guān)系。近年來的臨床研究對P-選擇素在DN中所起到的致病作用給予了充分的認(rèn)可，抗血小板藥物在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中能有效抑制（如高糖等誘導(dǎo)）P-選擇素的高度表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)抗凝治療DN的新方法。這些研究成果將為進(jìn)一步闡明DN與P—選擇素的關(guān)系及臨床治療提供了良好的思路與基礎(chǔ)［15］。

P—選擇素還可能成為糖尿病微血管病變的早期預(yù)測指標(biāo)［16］。高血糖使紅細(xì)胞膜變硬、血粘度增高，導(dǎo)致局部血流停滯，循環(huán)受阻，引起糖尿病患者肢體末端的微血管病變，形成糖尿病足壞疽。P-選擇素在糖尿病足壞疽患者中的高表達(dá)，有利于血栓風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測及抗血栓治療。

2.2 P-選擇素與糖尿病心臟病的關(guān)系

研究［17］表明，高血糖可刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P-選擇素及心肌細(xì)胞分泌單核趨化蛋白-1（MCP-1），后者誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞通過PSGL-1與內(nèi)皮細(xì)胞表面的P-選擇素以配體—受體模式相互作用，最終透過內(nèi)皮形成泡沫細(xì)胞。糖尿病心臟病時(shí)P-選擇素和MCP-1之間亦可能相互促進(jìn)表達(dá)，從而趨化單核巨噬細(xì)胞至心肌細(xì)胞間質(zhì)及使心肌細(xì)胞間質(zhì)等細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多，而 MCP-l可使心肌膠原蛋白I表達(dá)增多，心肌纖維增粗，心肌僵硬度增加［18］，從而共同參與糖尿病心臟病的發(fā)病。長期高血糖毒性作用能誘導(dǎo)P—選擇素表達(dá)增多，導(dǎo)致血漿和組織蛋白質(zhì)非酶糖基化，形成晚期糖基化終末產(chǎn)物，心肌中較多糖蛋白和晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成和沉積，可導(dǎo)致心肌收縮功能和順應(yīng)性減低，影響和損害組織或臟器功能。研究［19］證明，心臟舒張功能受損程度與P-選擇素濃度有關(guān)。

2.3 P-選擇素與糖尿病腦血管并發(fā)癥

在糖尿病合并腦血管并發(fā)癥時(shí)，P-選擇素在血漿中的表達(dá)也是增加的。有研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病合并腦血管并發(fā)癥血小板P—選擇素表達(dá)與2型糖尿病無血管并發(fā)癥和正常對照相比顯著增加。

3 結(jié) 語

臨床分析表明，糖尿病、高血壓、高脂血癥患者，甚至健康吸煙者，其體內(nèi)P—選擇素水平明顯高于正常人群［20］。與其它血小板標(biāo)志物比較，P-選擇素可以更靈敏地反映血小板活性。P-選擇素一方面可以作為活化血小板的標(biāo)志物，反映血栓前狀態(tài)，提示血栓形成傾向；同時(shí)也是抗血小板治療抑制血小板活化、減輕患者高凝狀態(tài)、改善糖尿病并發(fā)癥的有效監(jiān)測指標(biāo)之一。另一方面，P-選擇素本身也是一個(gè)重要的導(dǎo)致血栓形成的致病因素；而針對P—選擇素靶標(biāo)的抗血栓、抗黏附治療，可能會(huì)成為抗血栓形成的有效防治手段。所以，對P—選擇素生物學(xué)效應(yīng)及其與糖尿病、DN、糖尿病心臟病、糖尿病腦血管并發(fā)癥等的關(guān)系和機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)和研究，有助于糖尿病患者血栓事件的預(yù)防，同時(shí)也為抗血小板藥物的應(yīng)用和研發(fā)提供理論依據(jù)。

本文作者簡介：

顧慧群（1978～），女，漢族，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主管技師，主要從事止血與血栓檢驗(yàn)工作

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R587.1

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