紡錘體檢查點(diǎn)蛋白Cenp-E過低表達(dá)與肝癌細(xì)胞染色體異常的關(guān)系

蔡 勇,彭愛紅

（1.湖南博雅眼科醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南省臨床檢驗(yàn)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

早在1914年，德國(guó)科學(xué)家Theodor Boveri就認(rèn)為惡性細(xì)胞有不穩(wěn)定的染色體，這些不穩(wěn)定染色體能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。1998年，Peter等提出了非整倍體導(dǎo)致癌癥發(fā)生的假說，他們的實(shí)驗(yàn)表明非整倍體是獨(dú)立于基因突變外導(dǎo)致癌癥發(fā)生的機(jī)制[1]。SCP的功能就是監(jiān)測(cè)細(xì)胞染色體分離。檢查點(diǎn)功能喪失的一個(gè)后果是遺傳不穩(wěn)定性,促使細(xì)胞更容易惡變[2]。本試驗(yàn)通過間接免疫熒光和RNAi技術(shù)在HepG-2和LO2細(xì)胞中研究Cenp-E在HepG-2細(xì)胞染色體數(shù)目異常發(fā)生過程的作用，以期能夠發(fā)現(xiàn)Cenp-E在腫瘤細(xì)胞染色體數(shù)目異常中所起作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG-2細(xì)胞和LO2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，CENP-E兔一抗，羅丹明標(biāo)記Cenp-E紅色熒光二抗購(gòu)自Santa-Cruz公司。Alexa flour 350 Tubule藍(lán)色二抗購(gòu)自AB公司。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBICO公司。DIPA染料購(gòu)自Sigma公司。Trizol試劑購(gòu)自Invitroge公司，PrimeScript RT試劑盒購(gòu)自 TaKaRa公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自上海華舜公司。Lipofectamine 200購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 shRNA設(shè)計(jì)及質(zhì)粒的構(gòu)建

用Invitrogen公司在線設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)以Gen-Bank中CENP-E基因(編號(hào)NM.001813)的編碼區(qū)(CDS)為靶向的shRNA引物:正義鏈5'-GATCCCG-cACCG- ATGCTGGTGACCTCCAACAGAGAGCTCACCACCATCCGTGCTA-3',反義鏈5'-AGCTYAAAAAAGCACGCATGCTGGTGACCTCTCTCT FGAAGAGGTCACCAGCATCCGTGCGG-3'。

用BLAST軟件進(jìn)行同源性分析證實(shí)為靶基因高度保守區(qū)段后，送上海Invitrogen公司采用化學(xué)合成方法合成單鏈寡核苷酸；退火形成雙鏈DNA，插入線性載體pGenesil.1質(zhì)粒中；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5a后，挑選單克隆，經(jīng)擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定和DNA測(cè)序分析。

1.3 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA及實(shí)驗(yàn)分組

轉(zhuǎn)染的前一天將LO2細(xì)胞傳代到24孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為 1×105～2×105/孔，培養(yǎng) 12 h 以上，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組：pshRNA-Cenp-E-1+lipofectamine2000； 對(duì)照組：pgenesil-1+lipofectamine2000；空白組：ddH2O+lipofectamine2000。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Cenp-E mRNA表達(dá)

分別收集未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用已經(jīng)制備好的Cenp-E和內(nèi)參GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品及定量檢測(cè)的引物和探針，在ABI7000定量PCR儀上進(jìn)行RFQ-PCR擴(kuò)增。計(jì)算目的基因的mRNA拷貝數(shù)/內(nèi)參 GAPDH基因的mRNA拷貝數(shù)的比值，比較各組細(xì)胞內(nèi)Cenp-E mRNA的水平，以此來評(píng)價(jià)RNA干擾質(zhì)粒載體對(duì)目的基因表達(dá)的抑制作用。

1.5 間接免疫熒光檢測(cè)

首先在24孔板中制備細(xì)胞爬片，以每孔(1～2)×105個(gè)細(xì)胞接種到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)12～18 h后棄培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液，用預(yù)溫到37℃的PBS清洗細(xì)胞表面3次。用預(yù)冷到-20℃甲醇，-20℃固定20 min。PBS洗3次。10%羊血清封閉30 min。棄培養(yǎng)液，不洗，直接加入兔抗人Cenp-E 37℃孵育120 min。PBS洗3次。于暗室中加入羊抗兔二抗，37℃孵育60 min。PBS洗3次。加入DAPI37℃孵育5 min。50%甘油封片做激光共聚焦。

1.6 細(xì)胞周期分析

用100 ng/mL Nocodazole同時(shí)處理HepG-2和LO2細(xì)胞 6 h～12 h，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，DMEM重懸后移至1.5 mL離心管中，PBS離心清洗3遍后，加入PBS配制的 75%冰乙醇，4℃過夜，送重慶醫(yī)科大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)研究所做細(xì)胞周期分析。

1.7 染色體分析

對(duì)已長(zhǎng)滿80%LO2和HepG-2放入4℃冰箱中6～12 h，然后加入秋水仙素,37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)6～10 h，以獲得更多的中期分裂相細(xì)胞。收集細(xì)胞2500 r/min,離心5 min，加預(yù)溫到37℃的0.075 mol/L KCl 8mL,37℃水浴 15min；加 300μL 固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，充分混勻，2500 r/min 離心 5 min。 .重懸細(xì)胞，室溫放置30 min(或4℃過夜)，2000 r/min離心5 min,此步驟重復(fù)2次。去上清，加500 μL固定液，混勻，吸2～3滴在垂直距玻片約30～50 cm高度的位置滴在預(yù)冷的干凈玻片上，晾干，用Giemsa染色5～10min鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒鑒定

將雙酶切篩選出的陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序，結(jié)果顯示與設(shè)計(jì)的DNA片段序列完全一致，證實(shí)shRNA載體構(gòu)建成功。

2.2 RFQ-PCR結(jié)果

2.2.1 Nocodazole處理前后LO2細(xì)胞和HepG-2細(xì)胞熒光定量結(jié)果

從表1可見，用熒光定量PCR檢測(cè)Cenp-E基因在兩種細(xì)胞處理前后mRNA水平，以對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組樣品Cenp-E基因mRNA拷貝數(shù)/GAPDH基因mRNA拷貝數(shù)的均值作為該樣品中Cenp-E基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示處理前兩種細(xì)胞中Cenp-E基因mRNA水平用成組t檢驗(yàn)P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；處理后LO2細(xì)胞 Cenp-E基因 mRNA水平明顯高于 HepG-2細(xì)胞(P＜0.05)。

表1 LO2細(xì)胞和HepG-2細(xì)胞用Nocodazole處理前后熒光定量結(jié)果(Mean±SD)

2.2.2 LO2細(xì)胞干擾前后CENP-E mRNA表達(dá)RFQ-PCR檢測(cè)結(jié)果

Cenp-E mRNA表達(dá)RFQ-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LO2/shRNA-Cenp-E組的Cenp-E基因mRNA拷貝數(shù)/GAPDH基因mRNA拷貝數(shù)的比值為(1.2±0.1)×10-2， 與未轉(zhuǎn)染 LO2組 (8.8±0.1)×10-2和 LO2/pGenesil-1 空載對(duì)照組(9.8±0.1)×10-2比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示shRNA-Cenp-E質(zhì)粒載體能在mRNA水平上特異性地抑制LO2細(xì)胞中Cenp-E基因的表達(dá)。

2.3 細(xì)胞周期分析的流式結(jié)果

圖1 HepG-2和LO2細(xì)胞用Nocodazole處理前后的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

因?yàn)镃enp-E基因在分裂期高表達(dá)，在間期基本不表達(dá)，我們用Nocodazole處理使HepG-2細(xì)胞和LO2細(xì)胞同步在分裂期的細(xì)胞基本一樣多，便于在同一水平來分析Cenp-E基因在兩者之間的差異。流式細(xì)胞儀測(cè)定處理前后的HepG-2細(xì)胞和LO2細(xì)胞。結(jié)果顯示，處理前兩種細(xì)胞G2-M期的比例差異不顯著 (LO2處理前中期細(xì)胞比例是0.0967 ±0.0241，HepG-2 是 0.1250 ±0.0287，P ＞0.05)，結(jié)果見圖 1-A、C，處理后兩種細(xì)胞的 G2-M期細(xì)胞都大幅增加(圖1-B、D)。處理后兩組細(xì)胞中期細(xì)胞比例差異不顯著，處理后中期細(xì)胞比例LO2為 0.9543±0.275，HepG-2 為 0.9783±0.218，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示處理后兩種細(xì)胞同步在分裂期的細(xì)胞基本一樣多。

2.4 染色體分析結(jié)果

統(tǒng)計(jì)分析兩種細(xì)胞各100個(gè)以上中期細(xì)胞分裂像(圖2)，圖3為兩種細(xì)胞其中一個(gè)分裂像，結(jié)果顯示HepG-2細(xì)胞中染色體數(shù)目異常細(xì)胞的比例高于 LO2細(xì)胞。

圖2 HepG-2細(xì)胞和LO2細(xì)胞異常染色體的結(jié)果

圖3 部分染色體數(shù)目核型

2.5 間接免疫熒光結(jié)果

2.5.1 Nocodazole處理后HepG-2和LO2細(xì)胞間接免疫熒光結(jié)果

從圖4，5得知，在異常分裂的細(xì)胞核中，Cenp-E蛋白的表達(dá)量明顯比正常分裂的細(xì)胞少，說明Cenp-E的表達(dá)量過低可能是促使細(xì)胞錯(cuò)誤分裂的原因之一。

圖4 HepG-2細(xì)胞中異常有絲分裂細(xì)胞間接免疫熒光圖

圖5 LO2細(xì)胞中正常有絲分裂細(xì)胞間接免疫熒光圖

2.5.2.干擾CENP-E蛋白前后的間接免疫熒光結(jié)果

從圖 6，7可以觀察到 LO2細(xì)胞干擾以后，Cenp-E蛋白表達(dá)下降(紅色亮點(diǎn)減少)，與干擾前的細(xì)胞比較，干擾后LO2細(xì)胞的核分裂明顯出現(xiàn)異常。

圖6 干擾Cenp-E后LO2細(xì)胞間接免疫熒光結(jié)果

圖7 未干擾Cenp-E的LO2間接免疫熒光圖

2.5.3 核異常比例

從圖8可以看出干擾后LO2細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)衛(wèi)星核(大箭頭所示)，還有些核出現(xiàn)不規(guī)則的變化(小箭頭所示)。而在正常的LO2細(xì)胞核大致正常(圖9)。把干擾前后的細(xì)胞分別分析200個(gè)細(xì)胞核發(fā)現(xiàn)，干擾后LO2細(xì)胞核異常比例達(dá)到21%。而未干擾的細(xì)胞只有9%。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(如圖10)。

圖8 干擾后LO2細(xì)胞核型圖

圖9 未干擾的LO2細(xì)胞核型圖

圖10 LO2細(xì)胞干擾前后核異常比例圖

3 討論

Cenp-E是一種重要著絲粒特異蛋白，它主要定位于著絲粒的外層，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)它還是一種著絲粒點(diǎn)與微管有效連接的動(dòng)力蛋白。Abrieu等發(fā)現(xiàn)Cenp-E的細(xì)胞內(nèi)水平和定位皆受到嚴(yán)格控制?，F(xiàn)在越來越多的實(shí)驗(yàn)證明Cenp-E在研究紡錘體檢查點(diǎn)(spindle checkpoint,SCP)機(jī)制起著非常重要的作用，現(xiàn)在研究表明，一定量的Cenp-E水平，對(duì)SCP的激活是起非常重要的作用[3]。Cenp-E在著絲粒的定位要受到著絲粒組裝的上游蛋白質(zhì)如HsNU F、CENP-H[4]的影響。 在 SCP 機(jī)制，Cenp-E主要是通過自身的結(jié)構(gòu)變化影響B(tài)ubR1的功能來起作用[5]。

而另一方面在許多癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)有異常的SCP功能。例如，Mad2表達(dá)降低見于鼻咽癌、肝細(xì)胞癌、人乳腺癌及其一些乳腺癌細(xì)胞系和卵巢癌等，并與SCP缺陷切相關(guān)[6]。Bubl的mRNA降低也見于結(jié)腸癌和急性粒細(xì)胞性白血病[7]，高水平Bubl、BubR1和Bub3表達(dá)也與胃癌細(xì)胞增殖能力密切相關(guān)[8]。但Cenp-E與腫瘤之間的關(guān)系還不明確。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無論是 LO2細(xì)胞 還是HepG-2細(xì)胞，在用 Nocodazole處理之前，HepG-2細(xì)胞中分裂期細(xì)胞的比例(12.5%)略高于 LO2細(xì)胞(9.67%)，Cenp-E基因的mRNA量也高于LO2細(xì)胞，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)我們用Nocodazole處理兩種細(xì)胞，使它們都高度同步在分裂期，同時(shí)用熒光定量PCR檢測(cè)Cenp-E基因的mRNA表達(dá)量，處在分裂期的LO2細(xì)胞Cenp-E基因表達(dá)量明顯高于HepG-2細(xì)胞。我們推測(cè)，在正常培養(yǎng)的細(xì)胞中，由于兩種細(xì)胞分裂期細(xì)胞所占的比例均較低，Cenp-E基因表達(dá)的差異難以顯現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞被高度同步化于中期時(shí)這種差異才更為明顯。同時(shí)通過間接免疫熒光發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)錯(cuò)誤分裂的細(xì)胞中，Cenp-E蛋白表達(dá)量明顯比正常分裂的細(xì)胞少。由此表明LO2細(xì)胞在分裂期對(duì)Cenp-E基因表達(dá)的應(yīng)激上調(diào)能力高于 HepG-2，即肝癌細(xì)胞分裂期Cenp-E蛋白表現(xiàn)為相對(duì)缺乏，從而引起紡錘體檢查點(diǎn)監(jiān)控功能缺陷，導(dǎo)致分裂中期紡錘絲與染色體著絲粒未全部正常連接時(shí)細(xì)胞即進(jìn)入后期，引起細(xì)胞染色體數(shù)目異常。我們進(jìn)一步通過構(gòu)建Cenp-E小干擾RNA載體轉(zhuǎn)染到LO2細(xì)胞中。通過間接免疫熒光發(fā)現(xiàn)，在Cenp-E蛋白表達(dá)在被干擾的細(xì)胞中表達(dá)明顯下降，并且被干擾細(xì)胞的核分裂出現(xiàn)異常。通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)干擾Cenp-E的LO2細(xì)胞中的核異常的比例(21%)明顯高于未干擾的細(xì)胞(9%)。進(jìn)一步說明Cenp-E表達(dá)降低直接或間接影響著絲粒的正確裝配，最終導(dǎo)致染色體數(shù)目異常，細(xì)胞出現(xiàn)癌前病變[9]。但Cenp-E具體怎樣參與細(xì)胞染色體異常過程還不是很清楚。本研究從一個(gè)側(cè)面反映肝癌細(xì)胞分裂期 Cenp-E蛋白表達(dá)應(yīng)激性的增高能力。

明顯低于正常肝細(xì)胞。提示紡錘體檢查點(diǎn)蛋白Cenp-E的相對(duì)缺乏可能是肝癌細(xì)胞染色體數(shù)目異常形成的原因之一，為進(jìn)一步探明Cenp-E在腫瘤發(fā)生中的作用奠定基礎(chǔ)，從而對(duì)腫瘤患者的治療更有針對(duì)性。

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