不同胃黏膜病變組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA的表達(dá)

李曉麗,林 銳,李建生,李繼昌

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科;河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科鄭州 450052

△女,1977年2月生,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:消化道腫瘤,E-mail:lxl039921@sina.com

胃癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。胃癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因、多因素、多階段的動(dòng)態(tài)順序演變過(guò)程,涉及多種癌基因的激活、抑癌基因的失活及由此引起的細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。一氧化氮(nitric oxide,NO)是人體內(nèi)的一種具有生物活性的分子。內(nèi)源性NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化左旋-精氨酸(L-Arg)與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的[1]。機(jī)體對(duì) NO的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)對(duì)3種不同的NOS來(lái)實(shí)現(xiàn)的,即內(nèi)皮型NOS(eNOS)、神經(jīng)型NOS(nNOS)和誘導(dǎo)型NOS (iNOS),而iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量NO為其產(chǎn)生病理作用的基礎(chǔ)[2]。近年來(lái)有研究[3-4]顯示,在炎癥組織及多種腫瘤組織中均可檢測(cè)到表達(dá)上調(diào)的 iNOS,但iNOS在胃癌組織中表達(dá)情況的研究結(jié)果卻報(bào)道不一。作者選取不同病理階段的胃黏膜新鮮組織標(biāo)本,采用原位分子雜交方法對(duì)iNOSmRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),從分子水平探討iNOS與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選擇鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2006年 3月至 2007年 12月外科手術(shù)切除胃癌組織標(biāo)本65例,病理證實(shí)為腺癌,其中男 41例,女 24例;年齡(53.5±11.2)歲;腫瘤直徑:＜5 cm 31例,≥5 cm 34例;腫瘤部位:胃賁門部 20例,胃體部 28例,胃竇部17例;組織學(xué)分型:高、中分化37例,低分化28例;浸潤(rùn)深度:未侵及漿膜層 25例,侵及漿膜層及以外 40例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況:無(wú)轉(zhuǎn)移 24例,有轉(zhuǎn)移 41例;術(shù)前均未行放療和化療。另自胃鏡下取35例慢性淺表性胃炎、24例慢性萎縮性胃炎伴腸化生及 21例不典型增生胃黏膜組織標(biāo)本。慢性淺表性胃炎患者中男20例,女15例,年齡(38.2±10.7)歲;慢性萎縮性胃炎伴腸化生患者中男 13例,女 11例,年齡(50.4±5.6)歲;不典型增生患者中男11例,女 10例,年齡(52.5±6.7)歲。所取新鮮標(biāo)本均經(jīng) 40 g/L多聚甲醛液固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、4μm厚連續(xù)切片備用。以上標(biāo)本均經(jīng)HE染色及 2位病理學(xué)專家確認(rèn)。

1.2 不同胃黏膜病變組織中iNOSmRNA檢測(cè)方法 采用原位分子雜交法,原位分子雜交檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。組織切片常規(guī)脫蠟至水化;滴加體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫室溫15min,滴加體積分?jǐn)?shù)3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶,37℃30min以暴露mRNA片段;滴加預(yù)雜交液,37℃4 h;滴加雜交液,覆蓋蠟?zāi)?0～42℃恒溫箱過(guò)夜;梯度 SSC洗滌,滴加封閉劑,37℃30 min;滴加生物素化兔抗地高辛,37℃60min;滴加ABC,室溫20 min;DAB顯色;蘇木素復(fù)染、分化、脫水透明、封片。用不含探針的預(yù)雜交液代替雜交液作陰性對(duì)照,以已知肺癌陽(yáng)性染色切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定[5]iNOSmRNA以細(xì)胞胞質(zhì)著棕黃色為陽(yáng)性。染色結(jié)果綜合染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)行半定量分析。在排除非特異性染色及邊緣效應(yīng)的前提下,400倍光鏡下觀察并判定。每例觀察 5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù) 100個(gè)細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)判定:＜10%0分,10%～1分,25%～2分,50%～3分;染色強(qiáng)度判定:無(wú)著色 0分,染色弱 1分,染色清晰 2分,染色強(qiáng) 3分。結(jié)果取 2項(xiàng)評(píng)分之和:0～1分,陰性;≥2分,陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行分析,不同胃黏膜病變組織中iNOSmRNA陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn),不同病理特征胃癌組織中iNOSmRNA陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用 χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn) α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同胃黏膜病變組織中iNOSm RNA的檢測(cè)結(jié)果 iNOSmRNA主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞,巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞中亦有部分表達(dá)。在慢性淺表性胃炎胃黏膜腺體細(xì)胞中呈淡棕黃色,在慢性萎縮性胃炎伴腸化生和不典型增生胃黏膜腺體細(xì)胞中有中亦有表達(dá)。見(jiàn)圖 1和表 1。

2.2 iNOSmRNA表達(dá)與胃癌病理特征的關(guān)系65例胃癌組織中,iNOSmRNA的陽(yáng)性表達(dá)與組織學(xué)分型、浸潤(rùn)深度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),而與其腫瘤大小及部位無(wú)關(guān)。見(jiàn)表 2。

圖1 不同胃黏膜病變組織中iNOSmRNA染色結(jié)果(原位分子雜交法,×400)

表1 不同胃黏膜病變組織中iNOSmRNA的表達(dá)情況

表2 iNOSmRNA表達(dá)與胃癌病理特征之間的關(guān)系

3 討論

20世紀(jì) 80年代,NO才被認(rèn)識(shí)到是人體內(nèi)的一種具有生物活性的分子。人體內(nèi)的 NO有 2種來(lái)源,一種為非酶生型即來(lái)自于體表或攝入的無(wú)機(jī)氮的化學(xué)降解和轉(zhuǎn)化,一種為酶生型即由NOS催化合成。內(nèi)源性 NO既有細(xì)胞保護(hù)功能又具有細(xì)胞毒性的雙重作用,其作用方向取決于生成的 NO的量。而iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量NO為其產(chǎn)生病理作用的基礎(chǔ)[2]。現(xiàn)已證實(shí)[3-4]iNOS廣泛存在于人和哺乳類動(dòng)物的多種細(xì)胞中,包括多種腫瘤細(xì)胞及癌前病變組織細(xì)胞中,如肝癌、胰腺癌、大腸癌、食管癌和 Barrett's食管等。國(guó)外研究[6]發(fā)現(xiàn),在炎癥初期,NO主要起抗炎作用,隨炎癥的持續(xù)發(fā)展,大量的 NO釋放入組織并發(fā)揮組織損傷作用。同時(shí),炎癥病灶區(qū)存在許多激活的炎性細(xì)胞,炎性細(xì)胞可被誘導(dǎo)產(chǎn)生iNOS,隨iNOS活性增強(qiáng)將釋放大量NO和超氧化物,NO促進(jìn)內(nèi)源性亞硝胺形成,內(nèi)源性亞硝胺成為感染和炎癥組織發(fā)生腫瘤的危險(xiǎn)因素。還有研究[7]發(fā)現(xiàn),幽門螺旋桿菌感染可使胃黏膜 iNOS含量增加,而iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量NO及其供體在轉(zhuǎn)錄水平即可促進(jìn)炎癥損傷及誘發(fā)腫瘤形成。長(zhǎng)期慢性炎癥刺激已成為某些腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。該研究結(jié)果顯示,iNOSmRNA陽(yáng)性染色主要位于胃癌細(xì)胞胞質(zhì)中,巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞中亦有部分表達(dá)。在慢性淺表性胃炎胃黏膜腺體細(xì)胞中呈淡棕黃色弱表達(dá)。在慢性萎縮性胃炎伴腸化生、不典型增生胃黏膜腺體細(xì)胞中有中、高強(qiáng)度表達(dá)。提示,iNOS在促胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中遵循腸型胃癌發(fā)生模式:淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸化生→不典型增生→胃癌的順序演變過(guò)程,即iNOS參與了胃癌形成的全過(guò)程,并可能為其早期事件。而長(zhǎng)期慢性炎癥刺激又可能成為某些腫瘤發(fā)生的更早期危險(xiǎn)因素之一。所以,早期阻斷危險(xiǎn)因素或消除其產(chǎn)物將為臨床治療提供有效途徑及可靠理論依據(jù)。

研究[8]表明,iNOS可通過(guò)激活癌基因/抑制抑癌基因、抗凋亡/促增殖、促腫瘤血管生成、促腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和抑制宿主免疫等多種途徑參與胃癌的形成,iNOS蛋白的高表達(dá)與胃腺癌的腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及隨訪存活率有關(guān)。另有研究[9]表明,NO不僅可限制 T細(xì)胞的增生,且可提高前列腺素合成酶的活性而抑制NO介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用,從而削弱宿主抗腫瘤作用。該研究結(jié)果顯示,iNOSmRNA的表達(dá)與胃癌組織學(xué)分型、浸潤(rùn)深度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān),提示iNOS可能作為胃癌形成晚期的一個(gè)重要促侵襲轉(zhuǎn)移因子而加速腫瘤發(fā)展演進(jìn)。但也有相反的研究結(jié)果,如Cha等[10]則認(rèn)為 NO是內(nèi)源性的血管生成抑制劑。這 2種相反的結(jié)果可能是由于局部NO濃度不同所致,還有待于進(jìn)一步深入研究。

有研究[11]表明,聯(lián)合抑制 NO的非甾體抗炎藥較傳統(tǒng)的抗炎藥更具抗癌作用。提示,從分子水平研制更具選擇性的iNOS抑制劑或聯(lián)合性抑制劑,將為今后的臨床腫瘤防治工作提供有效途徑和美好前景。

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