RNA干擾對MCF-7細(xì)胞eIF4E表達(dá)的影響*

崔 瑩,孫淼淼,崔 黎,張 威,周 強(qiáng),陳奎生#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科;河南省腫瘤病理重點實驗室鄭州 450052 2)鄭州市衛(wèi)生學(xué)校病理學(xué)教研室鄭州 450005 3)河南省腫瘤醫(yī)院病理科鄭州 450003

#通訊作者,男,1964年3月生,博士,教授,研究方向:腫瘤病理,E-mail:chenksh2002@yahoo.com.cn

真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)是真核細(xì)胞翻譯水平上的重要調(diào)節(jié)因子,在人類多種腫瘤(頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、乳癌及胃癌等)組織中常呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),促進(jìn)腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移[1]。RNA干擾(RNA interfering,RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的內(nèi)源性基因沉默,可在mRNA水平上關(guān)閉相關(guān)基因的表達(dá)。作為一種新興的基因治療技術(shù),RNAi不僅成為分析人類基因組功能的有力工具,而且為腫瘤病因、免疫機(jī)制及基因治療等方面的研究開拓了廣闊的發(fā)展前景[2]。RNAi技術(shù)以其簡單快速、特異性高的特點,已被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的基因功能研究和基因治療等領(lǐng)域,與傳統(tǒng)的腫瘤治療方法相比,其針對性更強(qiáng),毒副作用更小[3]。作者觀察了RNAi技術(shù)體外對乳癌MCF-7細(xì)胞中eIF4E基因表達(dá)的影響,為應(yīng)用RNAi技術(shù)靶向治療乳癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 MCF-7細(xì)胞系由河南省醫(yī)藥科學(xué)研究所王慶端研究員惠贈。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司,T7 RiboMAXTMExpress RNAi System、SA-AP及BCIP/NBT購自美國Promega公司,脂質(zhì)體購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司,免疫組化SP試劑盒、胃蛋白酶及預(yù)雜交液購于武漢博士德生物工程有限公司,鼠抗人eIF4E多克隆抗體購于Santa Cruz公司,小分子干擾RNA(siRNA)模板及eIF4E cDNA探針(5'-CTAGCCAAAA GCGATCGAGG-3')由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2 靶向eIF4E siRNA的設(shè)計與合成 針對eIF4E基因的作用位點設(shè)計合成DNA模板,按T7 RiboMAX Express RNAiSystem轉(zhuǎn)錄說明進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,得到目的siRNA。無關(guān)模板按如上操作得到無關(guān)siRNA。

1.3 靶向eIF4E siRNA的轉(zhuǎn)染 將MCF-7細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)液(含青霉素、鏈霉素各100 U/ m L和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)中,在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細(xì)胞,按(2～6)×106/孔接種于 6孔培養(yǎng)板內(nèi)分組培養(yǎng)。分組培養(yǎng) 24 h后進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。實驗分組包括不同質(zhì)量濃度(100、150和 200mg/ L)siRNA轉(zhuǎn)染組、正常對照組(不進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、空白對照組(轉(zhuǎn)染時只加脂質(zhì)體)和無關(guān)對照組(轉(zhuǎn)染150mg/L無關(guān)siRNA)。轉(zhuǎn)染24、48和72 h后,收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為 106m L-1,將細(xì)胞滴于預(yù)處理的載玻片上固定,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MCF-7細(xì)胞eIF4E蛋白的檢測 采用免疫細(xì)胞化學(xué)法。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行, eIF4E一抗工作濃度1∶100,DAB顯色,中性樹膠封固。以PBS代替一抗作陰性對照,用已知eIF4E蛋白陽性表達(dá)的乳癌組織作陽性對照[2]。均重復(fù)5次。

1.5 MCF-7細(xì)胞eIF4E m RNA的檢測 采用原位雜交法,操作嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。以雜交前用RNase處理的樣本作陰性對照,用已知的eIF4E mRNA陽性表達(dá)的乳癌組織作陽性對照[4]。均重復(fù)5次。

1.6 結(jié)果判定 eIF4E蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性信號位于胞質(zhì)內(nèi),呈棕黃色;eIF4E mRNA原位雜交陽性信號位于胞質(zhì)內(nèi),呈藍(lán)紫色。每張滴片選取10個高倍視野,按陽性細(xì)胞百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定[5]。①陽性細(xì)胞百分比計分:＜1%為 0分,1%～為 1分,26%～為 2分,51%～為 3分, 76%～為 4分。②細(xì)胞著色強(qiáng)度計分:顯色為 0分,淡黃或淡藍(lán)色為 1分,棕黃或深藍(lán)色為2分,棕褐或藍(lán)紫色為 3分。2項得分之積為最終得分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析, 6組間及不同時間點間eIF4E蛋白及mRNA表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗;檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7細(xì)胞形態(tài)的變化 各siRNA轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞大部分體積縮小,部分細(xì)胞皺縮、漂浮。2.2 MCF-T細(xì)胞eIF4E蛋白及m RNA的表達(dá)

見表 1、2和圖 1、2。

表1 各組細(xì)胞eIF4E蛋白的表達(dá)(n=5)

表2 各組細(xì)胞eIF4E mRNA的表達(dá)(n=5)

3 討論

eIF4E是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的原癌基因,其過度表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[6]。Soni等[7]發(fā)現(xiàn),降低乳癌細(xì)胞中eIF4E的表達(dá),癌細(xì)胞的生長將明顯受抑制。因此,eIF4E基因有望成為腫瘤治療的新靶點。

動物實驗[8]證實采用RNAi技術(shù)抑制eIF4E基因的表達(dá)可有效抑制移植瘤組織的生長,提示運用RNAi技術(shù)針對eIF4E基因進(jìn)行腫瘤的基因治療具有一定的可行性。作者應(yīng)用RNAi技術(shù),針對eIF4E基因的特異性結(jié)合位點體外轉(zhuǎn)錄合成特異性siRNA,并以不同濃度轉(zhuǎn)染乳癌 MCF-7細(xì)胞。結(jié)果表明:隨著eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染濃度和時間的增加, MCF-7細(xì)胞生長受到抑制,eIF4E蛋白及mRNA的表達(dá)較對照組顯著下降。進(jìn)一步證實eIF4E siRNA可有效抑制 eIF4E癌基因的表達(dá),為臨床應(yīng)用eIF4E siRNA特異性治療乳癌提供了實驗依據(jù)。

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