乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中磷脂酶 A2蛋白的表達(dá)*

曲蘊(yùn)慧,龐 霞,趙 樂,李晟磊,陳奎生,賀付成

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科鄭州 450052 3)河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州 450052

△女,1980年5月生,碩士,主管技師,研究方向:腫瘤病理,E-mail:zdqyh09@126.com

磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)是具有甘油磷脂分解活性的酶類家族,廣泛存在于細(xì)菌、植物及哺乳動(dòng)物的多種組織、細(xì)胞和分泌物中,主要位于動(dòng)物細(xì)胞膜和線粒體膜上[1]。既往研究[2]表明, PLA2可合成具有不同生物活性的物質(zhì),并在磷脂的代謝和更換中發(fā)揮關(guān)鍵作用;PLA 2及其代謝產(chǎn)物除具有炎性介質(zhì)作用外,還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,與惡性腫瘤關(guān)系密切。作者采用免疫組織化學(xué) SP法檢測(cè)分泌型磷脂酶A2(sPLA2)-Ⅱa及胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)在57例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織、15例乳腺纖維腺瘤組織及 15例正常乳腺組織中的表達(dá)情況,探討sPLA2-Ⅱa及cPLA2在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)生發(fā)展中的作用,以期尋找乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌早期診斷和預(yù)后判斷的分子指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 57例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及15例乳腺纖維腺瘤均為鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 2007年 3月至 2009年 2月新鮮手術(shù)切除標(biāo)本,選取 15例乳腺腺病或乳腺炎手術(shù)切除標(biāo)本中的正常乳腺組織作對(duì)照,所有病例術(shù)前均無(wú)化療、放療及免疫治療史,均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)?；颊呔鶠榕?年齡29～87(50.3±11.3)歲。組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí) 9例,Ⅱ級(jí) 34例,Ⅲ級(jí) 14例;臨床分期Ⅰ期21例,Ⅱ期23例,Ⅲ期13例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 36例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例;腫瘤直徑＜2 cm者23例, 2～5 cm者27例,＞5 cm者7例。

1.2 3種乳腺組織中sPLA 2-Ⅱa及cPLA2蛋白的檢測(cè) 兔抗人sPLA2-Ⅱa及cPLA2多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法,sPLA2-Ⅱa及cPLA2抗體稀釋倍數(shù)為1∶200及1∶180,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。染色步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行,陽(yáng)性對(duì)照用已知陽(yáng)性染色的胃癌組織切片,陰性對(duì)照用 PBS代替一抗孵育組織切片。sPLA2-Ⅱa及cPLA 2陽(yáng)性信號(hào)呈黃色顆粒樣物質(zhì),均位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。高倍鏡下隨機(jī)選取 5個(gè)視野(每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于 200個(gè)),按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。結(jié)果取 2項(xiàng)評(píng)分之積,總分 ＜3分為陰性,≥3分為陽(yáng)性[3-4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,3種乳腺組織中及不同病理特征乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 2種蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用 χ2檢驗(yàn),浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 2種蛋白表達(dá)的關(guān)系通過(guò)計(jì)算Pearson列聯(lián)系數(shù)評(píng)價(jià),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3種乳腺組織中sPLA 2-Ⅱa和cPLA2蛋白的表達(dá)情況 sPLA2-Ⅱa蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)中,呈淺黃色至深黃色顆粒樣物質(zhì);cPLA2蛋白陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞質(zhì),呈棕黃色或深黃色顆粒樣物質(zhì)。見圖 1和表 1。

2.2 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中sPLA 2-Ⅱa和cPLA 2蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。sPLA2-Ⅱa和cPLA2蛋白表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。

2.3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中sPLA 2-Ⅱa與cPLA2蛋白表達(dá)的關(guān)系 結(jié)果見表3。

圖1 正常乳腺(A)、乳腺纖維腺瘤(B)及乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(C)組織中sPLA 2-Ⅱa和cPLA 2蛋白的表達(dá)(SP,×200)1:sPLA 2-Ⅱa蛋白;2:cPLA2蛋白。

表1 3種組織中sPLA 2-Ⅱa及cPLA 2的表達(dá) 例(%)

表2 sPLA 2-Ⅱa及cPLA 2蛋白表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

表3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中sPLA 2-Ⅱa及cPLA 2蛋白表達(dá)的關(guān)系 例

3 討論

乳癌是最常見的惡性腫瘤之一,近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì),且發(fā)病年齡也漸趨于年輕化。如何從分子水平來(lái)尋找乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌可能的分子治療靶點(diǎn)長(zhǎng)期以來(lái)備受人們關(guān)注。該研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)比了正常乳腺、乳腺纖維腺瘤及乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中cPLA2及sPLA2-Ⅱa蛋白的變化規(guī)律及其與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系。

PLA2的調(diào)節(jié)根據(jù)其存在部位、氨基酸順序同源性和生化功能特征不同,可分為3種類型:sPLA2、cPLA2和Ca2+非依賴型磷脂酶A2(iPLA2)。sPLA2包括sPLA2-Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ和Ⅹ等,存在于胞質(zhì)的顆粒中或在細(xì)胞受刺激后合成并釋放至細(xì)胞外,對(duì)磷脂Sn-2位的脂肪酸無(wú)選擇特異性;cPLA2廣泛存在于體內(nèi)各種組織細(xì)胞中,活化時(shí)需要 Ca2+的參與和上游激酶的磷酸化作用,并可優(yōu)先選擇性地水解磷脂Sn-2位釋放氨基酸(AA)。sPLA2和cPLA2都表現(xiàn)出對(duì)Ca2+的高度敏感性;iPLA2包括iPLA2-Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ,iPLA2對(duì)AA沒有優(yōu)先選擇性,不需Ca2+維持其催化活性。iPLA2-Ⅵ曾被認(rèn)為參與細(xì)胞膜的重建,另外一些學(xué)者[5]認(rèn)為 iPLA2-Ⅵ也參與細(xì)胞受刺激后的 AA釋放過(guò)程。不同類型的PLA2結(jié)構(gòu)、功能各有不同,但其生理生化特性卻有許多相似之處。PLA2具有熱穩(wěn)定性,置于65℃環(huán)境中75min或90℃30min活性不變;易溶于水,但其水解聚集狀態(tài)底物(如脂微團(tuán)、單層和雙層膜脂)的活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于水解分散存在底物的活力,即其主要催化的是非均相反應(yīng);其底物分子排列方式影響酶活性。PLA 2可被許多物理、化學(xué)及生物因素激活,如機(jī)械損傷、內(nèi)毒素、血管緊張素Ⅱ、泌乳素、緩激肽、凝血酶、氧自由基和抗原等。一些細(xì)胞因子,如IL-1、TNF、IFN、PAF也能激活PLA2。

sPLA 2-Ⅱa廣泛地分布在哺乳動(dòng)物的組織和細(xì)胞中,但酶的活性變化相當(dāng)大[6]。取人組織標(biāo)本提取液用放射化學(xué)法測(cè)定sPLA 2-Ⅱa的酶活性發(fā)現(xiàn):消化道、軟骨、腮腺和前列腺含大量sPLA2-Ⅱa,而在骨骼、骨骼肌、心、腦、腎、肝、肺、脾、胰腺、胎盤和羊膜中其活性卻很低[7]。研究[8]表明,sPLA2-Ⅱa可被許多物理、化學(xué)、生物因素及一些細(xì)胞因子激活,sPLA2-Ⅱa可使膜磷脂Sn-2位的脂酰鍵水解后,通過(guò)環(huán)氧化酶及脂加氧酶途徑,產(chǎn)生溶血磷脂及不飽和脂肪酸,它們既是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游效應(yīng)物,也可作為脂質(zhì)炎癥介質(zhì),參與機(jī)體的一系列生理病理過(guò)程。cPLA2廣泛存在于人類各種組織中,其含量較sPLA 2-Ⅱa相對(duì)穩(wěn)定,在肺和腦組織海馬中含量略高。與sPLA2-Ⅱa一樣,cPLA2的激活也受到許多物理、化學(xué)、生物因素及一些細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。在缺乏Ca2+升高的情況下,cPLA2也能被激活。cPLA2被激活后,水解磷脂,生成花生四烯酸等活性物質(zhì),啟動(dòng)炎癥反應(yīng),引起機(jī)體多種疾病[9]。

該研究結(jié)果顯示:sPLA2-Ⅱa和cPLA2在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)高于正常對(duì)照組織,表明sPLA2-Ⅱa和cPLA2參與了乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)病過(guò)程,并可能在其中發(fā)揮重要作用。該研究結(jié)果還表明,不同組織分化程度及臨床分期的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中sPLA2-Ⅱa和cPLA2的表達(dá)亦不同,隨組織分化程度降低,其表達(dá)增高。而腫瘤的分化程度和分期影響腫瘤的預(yù)后,提示sPLA2-Ⅱa和cPLA2與腫瘤的預(yù)后及生物學(xué)行為有關(guān)。另外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組織sPLA2-Ⅱa和cPLA2表達(dá)高于陰性組織,說(shuō)明sPLA2-Ⅱa和cPLA 2與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的惡性程度有關(guān)。作者認(rèn)為sPLA2-Ⅱa和cPLA2可作為影響乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌浸潤(rùn)行為和預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。但其作用的分子機(jī)制及其潛在的作用,還有待于進(jìn)一步深入研究。

總之,對(duì)cPLA2及sPLA2-Ⅱa的深入研究有利于進(jìn)一步了解乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的生物學(xué)特性,為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的早期診斷和治療提供新的發(fā)展方向。

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