人臍血MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化過程中neurogenin 1的表達(dá)變化*

朱登納， 賈延劼， 王 軍， 張博愛， 范亞珍

(鄭州大學(xué)1第三附屬醫(yī)院河南省小兒腦癱康復(fù)治療中心，2第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南鄭州450052)

近年來，干細(xì)胞移植可替代損傷的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能重建，是治療神經(jīng)系統(tǒng)病變新的理念和途徑［1］。間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化、高度增殖及自我更新能力，被認(rèn)為是細(xì)胞治療中最具發(fā)展?jié)摿Φ募?xì)胞來源之一，具有很大的應(yīng)用價(jià)值［2］，在一定條件下可增殖分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等［3，4］。神經(jīng)元素1(neurogenin 1)屬于一種早表達(dá)的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)蛋白，可以在神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)，是控制神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)育成神經(jīng)細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子之一［5］。但是，neurogenin 1是否在其它類型的干/前體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中也存在類似的作用呢?相關(guān)研究不多。本研究采用表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)聯(lián)合誘導(dǎo)人臍血MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，觀察neurogenin 1的表達(dá)變化，并初步探討其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 Neurobasal液體培養(yǎng)基、B27和胎牛血清購自Gibco;淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?;hEGF、bFGF購自PeproTech Ec;小鼠抗人neurogenin 1(sc-100332)、神經(jīng)微絲亞蛋白M(neurofilament protein M，NF-M，sc-20013)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE，sc-51880)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，sc-58766)單克隆抗體購自Santa Cruz;CY3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自上海碧云天公司;RNeasy Mini試劑盒和OneStep RT-PCR試劑盒均為Qiagen公司產(chǎn)品;引物由上海生工生物公司合成。

2 方法

2.1 臍血采集和MSCs分離 人臍血標(biāo)本2007年10月-2009年12月取自鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，書面獲產(chǎn)婦同意，足月妊娠，剖腹產(chǎn)，排除傳染性疾病及各種家族遺傳疾病。無菌狀態(tài)下從新生兒胎盤收集臍血70 mL 30份于含14 mL CPD-A抗凝劑的100 mL采血袋內(nèi)，混勻后分裝于離心管中，3 000 r/min離心10 min，棄上層血漿，加入等量生理鹽水混勻，緩慢加入到含F(xiàn)icoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2 500 r/min離心15 min，細(xì)胞分為4層，取中間富含單個(gè)核細(xì)胞的白膜層，Hanks液洗滌離心2次，棄上清，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液作用30 s，Hank's液洗滌離心1次，棄上清，制成單個(gè)核細(xì)胞懸液。

2.2 體外誘導(dǎo)人臍血MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞 參照文獻(xiàn)［6］的方法，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109cells/L，接種于含EGF (10 μg/L)、bFGF(10 μg/L)和B27(2%)的neurobasal培養(yǎng)基的塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)24 h后傾去全部液體以去除未貼壁細(xì)胞，以后每3 d全量換液1次，分別收集培養(yǎng)0 d、1 d、4 d、7 d、14 d的貼壁細(xì)胞。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法 取各時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS洗滌后加入3%H2O2去離子水孵育5 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。山羊血清孵育30 min，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，分別加入neurogenin 1抗體(2.0 mg/L)、NF -M抗體(1.0 mg/L)、NSE抗體(1.0 mg/L)、GFAP抗體(1.0 mg/L)4℃孵育，PBS洗滌后用CY3標(biāo)記山羊抗兔IgG (1∶500)在室溫下進(jìn)行染色標(biāo)記、觀察。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及陽性細(xì)胞表達(dá)情況。細(xì)胞圖像通過顯微鏡用100倍或200倍攝取，圖像均采用300 dpi分辨率。每組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)都會(huì)采集超過20個(gè)區(qū)域的細(xì)胞。而且，采用雙人雙盲隨機(jī)記數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比例。

2.4 Western blotting法 收集培養(yǎng)0 d、7 d、14 d的細(xì)胞，在細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，10 mmol/L EDTA，2%SDS，5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF)100 μL中裂解、變性、離心，收集上清蛋白質(zhì)樣本，蛋白質(zhì)定量。取50 μg蛋白在12%的SDS-PAGE膠中電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。取出膜后用正常山羊血清室溫下封閉3.5 h，然后置于雜交袋中，加入小鼠抗人neurogenin 1(1∶500)，4℃孵育過夜，羊抗小鼠-AP(1∶1 000)，37℃孵育60-120 min，NBT/BCIP顯色，照相記錄結(jié)果。

2.5 RT-PCR Neurogenin 1引物參考Megiorni等［7］，上游引物5'-CCGACGACACCAAGCTCA-3'，下游引物5'-GAATGAAACAGGGCGTT-3'，產(chǎn)物334 bp;β-actin上游引物5'-TCATACTCCTGCTTGCTG-3'，下游引物5'-GGACCTGACTGACTACCTC-3'，產(chǎn)物540 bp;均由上海生工生物公司合成，終濃度為100 μmol/L。

采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照QIAGEN? OneStep RT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行RTPCR，總反應(yīng)體積50.0 μL。擴(kuò)增條件為:50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95℃初始化15 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30-35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸10 min。然后，取RT-PCR產(chǎn)物5.0 μL，加樣至含溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠上，70 V電泳25 min，紫外透視儀下觀察結(jié)果并用凝膠掃描成像系統(tǒng)照相，PCR定量分析軟件分析各樣本的PCR吸光度，除以各內(nèi)對(duì)照β-actin的PCR吸光度值作為各目的mRNA的表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析和卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 人臍血MSCs體外分離和誘導(dǎo)分化

剛分離的MSCs呈體積均一的小圓形，折光性強(qiáng)，懸浮狀態(tài)，少量聚集成細(xì)胞簇;誘導(dǎo)1 d后，細(xì)胞開始增殖分化，出現(xiàn)貼壁生長，胞體變大，邊緣有細(xì)的突起，形狀變得不規(guī)則。部分細(xì)胞呈破骨樣，胞體較大，多個(gè)核，類圓形(圖1A);4 d后可見球形細(xì)胞克隆團(tuán)，細(xì)胞清亮，折光性好。梭形細(xì)胞增多，胞突進(jìn)一步伸長，細(xì)胞呈梭形、三角形、不規(guī)則錐形，甚至多個(gè)突起。破骨樣細(xì)胞減少，細(xì)胞視野逐漸清亮;7 d時(shí)貼壁細(xì)胞突起逐漸延長，分支逐漸增多，球形細(xì)胞克隆團(tuán)體積變大，貼壁生長，隨后單個(gè)細(xì)胞呈放射狀從細(xì)胞球周圍遷出來，細(xì)胞逐漸純化;14 d后相鄰細(xì)胞突起逐漸連成網(wǎng)狀，類似神經(jīng)元樣細(xì)胞。中間散在大的克隆球，周圍放射狀伸出許多細(xì)長突起并進(jìn)一步延長(圖1B)。

2 誘導(dǎo)前后NF－M、NSE和GFAP蛋白表達(dá)

誘導(dǎo)前人臍血MSCs NF-M、NSE和GFAP的表達(dá)均非常低(＜1.0%)誘導(dǎo)4d，NF-M和NSE陽性細(xì)胞數(shù)較誘導(dǎo)1 d顯著增多(P＜0.01)，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)也同樣增多(P＜0.01)。誘導(dǎo)7 d后NSE陽性細(xì)胞率達(dá)高峰;誘導(dǎo)14 d，NSE陽性細(xì)胞率略有下降，但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。NF-M和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)則繼續(xù)增多，所占比例不斷增高，見表1。

Figure 1.Morphological changes of MSCs after induction(×200).A:after 1-day induction，the cells began to proliferate and differentiate，and adherent growth，large soma，thin processes and irregular shape were observed.Some were osteoclast-like cells，with comparatively large soma，round-like shape and multiple nuclei.B:after 14-day induction，it was observed that large cell colonies scattered in the network connected by cell processes，similar to the neuron-like cells.圖1 誘導(dǎo)后MSCs的形態(tài)變化

Figure 2.The expression of neurogenin 1 reached to its peak after 14-day induction(×200).A:under light microscope;B:the same field under fluorescence microscope(×200).圖2 誘導(dǎo)14后neurogenin 1的表達(dá)

表1 誘導(dǎo)不同時(shí)點(diǎn)后MSCs免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果Table 1 .Results of immunocytochemical staining in MSCs at different time points after induction(%.n=20)

3 Neurogenin 1的表達(dá)變化

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果提示，誘導(dǎo)前(0 d)人臍血MSCs不表達(dá)neurogenin 1;誘導(dǎo)1 d，MSCs開始少量表達(dá) neurogenin 1 (1.7% ±0.5%);誘導(dǎo)4 d，部分 MSCs表達(dá) neurogenin 1 (16.8%±4.6%);而且隨時(shí)間延長表達(dá)持續(xù)增加，峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)14 d(42.5% ±6.0%)，與誘導(dǎo)4 d、7 d(30.8% ± 9.4%)相比，有顯著差異(P＜0.01)，見圖2。Western blotting法也有類似的結(jié)果，見圖3。

RT-PCR結(jié)果提示，neurogenin 1 mRNA在誘導(dǎo)前的MSCs中不表達(dá)，誘導(dǎo)后表達(dá)逐漸升高，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，neurogenin 1 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，見圖4。

Figure 3.Neurogenin 1 expression detected by Western blotting. The human umbilical cord blood MSCs did not express neurogenin 1 before induction(0 d);After inducted 1 day，MSCs began to express a small amount of neurogenin 1;and the expression continued to increase after induced 4 days，14 days with time prolonged.±s.n= 10.△△P＜0.01 vs 0 d group;＊＊P＜0.01 vs 4 d group.圖3 Western blotting檢測neurogenin 1蛋白表達(dá)

Figure 4.The expresssion of neurogenin 1 mRNA in MSCs detected by RT-PCR was low before induction，gradually increased after induction，and significantly increased with the induction prolonged.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs 0 d group;△△P＜0.01 vs 1 d group; ##P＜0.01 vs 4 d group;▲▲P＜0.01 vs 7 d group.圖4 RT－PCR檢測neurogenin 1 mRNA表達(dá)結(jié)果

討論

研究發(fā)現(xiàn)，臍血和骨髓都含有間質(zhì)干細(xì)胞，且人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞更原始，增殖分化能力更強(qiáng)。因此，為細(xì)胞治療的來源提供了一個(gè)的選擇［8］。本研究建立了用含EGF、bFGF和B27的神經(jīng)細(xì)胞Neurobasal培養(yǎng)基，體外誘導(dǎo)人臍血MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法。bFGF在胚胎發(fā)育早期對(duì)能分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞具有促增殖作用，并能保持神經(jīng)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)［9，10］。而EGF僅在胚胎發(fā)育晚期對(duì)膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。將二者聯(lián)合用于神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，也可以選擇性地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化［11］。B27具有維持神經(jīng)細(xì)胞活性的作用。結(jié)果提示誘導(dǎo)4d，NF-M、NSE陽性細(xì)胞數(shù)開始顯著增多，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)也同樣增多。誘導(dǎo)14d，NF-M、GFAP陽性細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增多，所占比例不斷增高。推測在體外微環(huán)境中EGF、bFGF、B27與細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞分泌因子一起通過復(fù)雜的受體相互作用，影響人臍血MSCs增殖分化的基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)人臍血MSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。

Neurogenin 1是一類在神經(jīng)細(xì)胞前體中表達(dá)、控制神經(jīng)細(xì)胞前體發(fā)育成神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，屬于早表達(dá)的bHLH蛋白中的一種。根據(jù)bHLH轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在神經(jīng)分化過程中作用的先后，可將其分為決定因子和分化因子。決定因子參與了決定NSCs向神經(jīng)元譜系分化的調(diào)節(jié)過程，比分化因子較早作用于神經(jīng)細(xì)胞分化過程;分化因子作用于神經(jīng)前體細(xì)胞向多種不同類型神經(jīng)元分化的調(diào)節(jié)過程，使之產(chǎn)生各種完全分化的神經(jīng)元［12］。采用維甲酸處理 P19細(xì)胞可以誘導(dǎo)neurogenin 1與另外一種bHLH蛋白NeuroD在P19細(xì)胞神經(jīng)分化早期階段表達(dá)，在缺乏維甲酸的情況下，neurogenin 1也可以誘導(dǎo)P19細(xì)胞的神經(jīng)分化［13］。而且，neurogenin 1在控制神經(jīng)元發(fā)育和膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生中有雙重作用:一方面neurogenin 1作為轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)NeuroD的表達(dá)，而NeuroD對(duì)神經(jīng)發(fā)育有重要作用;另一方面，neurogenin 1通過阻斷復(fù)合物p300/CBP與GFAP啟動(dòng)子之間的作用，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生［14，15］。本研究表明，誘導(dǎo)前人臍血MSCs不表達(dá)neurogenin 1。在EGF和bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)下，neurogenin 1表達(dá)逐漸增強(qiáng)，誘導(dǎo)14 d達(dá)到峰值。與此同時(shí)，NF-M和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)也逐漸增多，提示人臍血MSCs在向神經(jīng)細(xì)胞分化的過程中，隨著神經(jīng)分化的進(jìn)行，neurogenin 1表達(dá)平行升高，可能在人臍血MSCs神經(jīng)細(xì)胞分化中起到一定的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，采用表達(dá)neurogenin 1的骨髓MSCs移植到腦缺血?jiǎng)游锬X組織，可以促進(jìn)MSCs橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞，修復(fù)受損組織，重建細(xì)胞功能，改善神經(jīng)功能缺損癥狀［16］。因此，進(jìn)一步研究neurogenin 1在人臍血MSCs神經(jīng)細(xì)胞分化中的機(jī)制，調(diào)控其表達(dá)，為今后人臍血MSCs治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性及損傷性疾病提供一定的基礎(chǔ)。

［1］ Low CB，Liou YC，Tang BL.Neural differentiation and potential use of stem cells from the human umbilical cord for central nervous system transplantation therapy［J］.J Neurosci Res，2008，86(8):1670-1679.

［2］ 唐曉瓊，趙智剛，王紅祥，等.人臍靜脈來源的間質(zhì)干細(xì)胞體外分離擴(kuò)增及多向分化的研究［J］.中國病理生理雜志，2006，22(10):1960-1964.

［3］ Domanska JK，Buzanska L，Lukomska B.A novel，neural potential of non-hematopoietic human umbilical cord blood stem cells［J］.Int J Dev Biol，2008，52(2-3): 237-248.

［4］ 劉建坤，孫志明，閆嶂松，等.臍血干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生和后肢運(yùn)動(dòng)功能的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(16):2433-2437.

［5］ Blader P，Lam CS，Rastegar S，et al.Conserved and acquired features of neurogenin1 regulation［J］.Development，2004，131(22):5627-5637.

［6］ Yan WH，Cao MD，Liu JR，et al.Effects of EGF and bFGF on expression of microtubule-associated protein tau and MAP-2 mRNA in human umbilical cord mononuclear cells［J］.Cell Biol Int，2005，29(2):153-157.

［7］ Megiorni F，Mora B，Indovina P，et al.Expression of neuronal markers during NTera2/cloneD1 differentiation by cell aggregation method［J］.Neurosci Lett，2005，373 (2):105–109.

［8］ J?ger M，Zilkens C，Bittersohl B，et al.Cord blood-an alternative source for bone regeneration［J］.Stem Cell Rev，2009，5(3):266-277.

［9］ Tamama K，F(xiàn)an VH，Griffith LG.Epidermal growth factor as a candidate for ex vivo expansion of bone marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2006，24 (3):686-695.

［10］ Rider DA，Dombrowski C，Sawyer AA.Autocrine fibroblast growth factor 2 increases the multipotentiality of human adipose-derived mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2008，26(6):1598-1608.

［11］ Hebert TL，Wu X，Yu G.Culture effects of epidermal growth factor(EGF)and basic fibroblast growth factor (bFGF)on cryopreserved human adipose-derived stromal/stem cell proliferation and adipogenesis［J］.J Tissue Eng Regen Med，2009，3(7):553-561.

［12］ 王若冰，楊 雪，金玫萍，等.神經(jīng)干細(xì)胞分化調(diào)節(jié)機(jī)制與應(yīng)用前景［J］.中國病理生理雜志，2007，23(2): 403-407.

［13］ Kim S，Yoon YS，Kim JW，et al.neurogenin 1 is sufficient to induce neuronal differentiation of embryonal carcinoma P19 cells in the absence of retinoic acid［J］.Cell Mol Neurobiol，2004，24(3):343-356.

［14］ Wu M，Zhang Y，Wu NH，et al.Histone marks and chromatin remodelers on the regulation of neurogenin 1 gene in RA induced neuronal differentiation of P19 cells［J］.J Cell Biochem，2009，107(2):264-271.

［15］ Sun Y，Nadal-Vicens M，Misono S，et al.Neurogenin promotes neurogenesis and inhibits glial differentiation by independent mechanisms［J］.Cell，2001，104(3):365-376.

［16］ Kim SS，Yoo SW，Park TS，et al.Neural induction with neurogenin 1 increases the therapeutic effects of mesenchymal stem cells in the ischemic brain［J］.Stem Cells，2008，26(9):2217-2228.