城市生活垃圾除臭酵母的篩選與鑒定

許麗娟，魏小武，孫翔宇，陳 薇，賀月林

(湖南省微生物研究所，湖南長(zhǎng)沙 410009)

城市生活垃圾治理是目前我國(guó)城市面臨的最嚴(yán)重的環(huán)境問題之一。我國(guó)城市生活垃圾年清運(yùn)量約為1.5億t，除少部分焚燒、堆肥或回收利用外，絕大部分被運(yùn)送到填埋場(chǎng)進(jìn)行處置。這些城市固體廢棄物在轉(zhuǎn)運(yùn)、堆放處理過程中產(chǎn)生大量臭氣［1］。惡臭氣體不僅污染空氣，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成影響，還會(huì)導(dǎo)致人、畜疾病的傳播，影響居民的正常生活和身體健康［2］。筆者通過對(duì)城市生活垃圾除臭酵母的篩選及鑒定，獲得無害、高效的除臭酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

試驗(yàn)菌種是從城市生活垃圾中分離、純化出來的具有一定除臭效果的酵母菌，從中優(yōu)選出3株，分別為 J1、J2、J3。生活垃圾取自瀏陽(yáng)垃圾填埋場(chǎng)。

1.2 培養(yǎng)基

分離純化用麥芽汁培養(yǎng)基［3］，培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基［4］。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的初篩

按10%接種量接入所試菌株于發(fā)臭垃圾中，以自來水作為對(duì)照，分別于接種后24h、48h、72h使用便攜式氨氣檢測(cè)儀NBX80－NH3檢測(cè)，初步判斷各菌株的除臭效果，對(duì)經(jīng)便攜式檢測(cè)儀測(cè)定有除臭能力的微生物進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 菌株的復(fù)篩

取18ml菌液于2L大燒杯中，加入500mg/L的氨水2ml;再往大燒杯中放入裝有20ml 0.005N硫酸吸收液的50ml小燒杯，大燒杯蓋上雙層塑料薄膜密封。以等量的無菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，取出小燒杯檢測(cè)氨的濃度。氨的測(cè)定采用納氏試劑比色法［5］。

1.3.3 酵母菌的鑒定

對(duì)篩選出的脫氨作用最強(qiáng)的菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察并結(jié)合一些生理學(xué)試驗(yàn)來進(jìn)行鑒定。

1.3.3.1 菌落和菌體形態(tài)學(xué)觀察

將新培養(yǎng)的酵母接于PDA平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，觀察菌落形態(tài);用接種環(huán)以無菌操作法挑取菌落少許，制成水浸片，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3.2 菌的生理生化特性

糖類發(fā)酵試驗(yàn)［6］。往試管內(nèi)注入12.5%的豆芽汁3.2ml，并于每支試管內(nèi)放入一倒置的杜氏小管，試管口包扎好后，115℃滅菌20min備用。分別于上述每支試管內(nèi)加入10%葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖糖液0.8ml，靜置2h，使杜氏管內(nèi)外的糖液均勻擴(kuò)散。將J3菌分別接種于含糖試管中，置30℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3d后觀察，杜氏管內(nèi)有氣泡存在則說明J3菌可發(fā)酵該種糖類。

硝酸鹽利用試驗(yàn)［7］。①將測(cè)試酵母菌進(jìn)行饑餓培養(yǎng)。把活化好的菌株接種在4ml無菌碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)5～7d，以消耗細(xì)胞內(nèi)多余的氮源，防止出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。②制備碳源基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基。取11.7g酵母碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，20g純化瓊脂粉，加1000ml蒸餾水，加熱將瓊脂粉熔化后經(jīng)115℃滅菌30min，冷卻至大約45℃時(shí)倒入預(yù)先已加入1ml饑餓培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞懸液的平板中，混勻后靜置，凝固后放在25℃培養(yǎng)箱內(nèi)數(shù)小時(shí)，使平板表面干燥，然后把少量所測(cè)氮源化合物點(diǎn)在平板上。點(diǎn)置試劑后的平板在25℃下培養(yǎng)2～3d，觀察結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)者在所點(diǎn)試劑處或周圍有酵母菌落生長(zhǎng)。

產(chǎn)生類淀粉化合物試驗(yàn)［6］。將菌株J3劃線接于PDA固體培養(yǎng)基中，置于28℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，待長(zhǎng)好后，向平板上傾入盧哥氏 (Lugo1)碘液，若酵母菌落周圍呈現(xiàn)藍(lán)色，則為陽(yáng)性。

產(chǎn)酸試驗(yàn)［6］。在含碳酸鈣的PDA斜面上接種酵母菌，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)10d后觀察，能產(chǎn)酸的酵母菌能使碳酸溶解而導(dǎo)致培養(yǎng)基呈現(xiàn)透明。

尿酶試驗(yàn)［8］。取新培養(yǎng)的酵母菌，接種于作水解尿素試驗(yàn)的瓊脂斜面上，28℃培養(yǎng)。5～7d后，如瓊脂斜面上呈淡紅色，則此酵母能分解尿素。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩實(shí)驗(yàn)

對(duì)分離出的數(shù)株菌株進(jìn)行了初步的降氨實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3株菌株表現(xiàn)出較好的除臭作用。且根據(jù)感觀判斷，J3菌株除臭能力最強(qiáng)，J2菌株略優(yōu)于J1菌株，但初篩實(shí)驗(yàn)只是一個(gè)簡(jiǎn)單的定性實(shí)驗(yàn)，還需要作進(jìn)一步的定量實(shí)驗(yàn)以判斷各菌株除臭能力的強(qiáng)弱。

2.2 復(fù)篩實(shí)驗(yàn)

將初篩試驗(yàn)中有除臭作用的3株菌株做進(jìn)一步的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，以確定各菌株降氨能力的大小，復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，24h內(nèi)，J1、J2、J3的脫氨率分別為65%、60%、85%，其中J3對(duì)氨的去除率最高，除臭效果也最穩(wěn)定。復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果與初篩實(shí)驗(yàn)基本相符，但不難看出初篩實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性，在初篩實(shí)驗(yàn)中J2的除臭效果要優(yōu)于J1，但復(fù)篩實(shí)驗(yàn)正好相反，因此，只有將初篩與復(fù)篩方法相結(jié)合才能獲得高效脫臭菌株。

2.3 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)J3菌株的菌落及菌體形態(tài)進(jìn)行了觀察。從圖2、圖3可見，在PDA固體培養(yǎng)基上J3菌株菌落圓形，濕潤(rùn)光滑，中間凸起，邊緣整齊，易挑起，顏色乳白色;光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)胞橢圓形，細(xì)胞的生殖方式為芽殖。

圖2 J3菌株的菌落特征

圖3 J3菌株的菌體形態(tài)

2.4 生化試驗(yàn)

在形態(tài)學(xué)分析的基礎(chǔ)上，對(duì)該菌株進(jìn)行了進(jìn)一步的生理生化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，J3菌株糖類發(fā)酵、硝酸鹽試驗(yàn)、產(chǎn)類淀粉試驗(yàn)及產(chǎn)酸試驗(yàn)均呈陰性，尿酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，按J·Lodder(1970)酵母分類學(xué)鑒定的方法進(jìn)行酵母的分類，將其歸為擲孢酵母。

表1 J3菌株的生理生化結(jié)果

3 結(jié)論

城市生活垃圾在轉(zhuǎn)運(yùn)、堆放處理過程中產(chǎn)生大量臭氣，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。臭氣中對(duì)人畜健康影響最大的有害氣體主要是氨氣和硫化氫。本試驗(yàn)以氨的釋放量作為判定菌株除臭能力的一個(gè)指標(biāo)，采用初篩與復(fù)篩相結(jié)合的方法，從垃圾中分離篩選出了一株能明顯降低氨氣釋放量的J3菌株，其對(duì)氨的去除率達(dá)80%以上。通過對(duì)J3菌株的菌落特征及菌體形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)，初步確定J3菌株為擲孢酵母 (Sporobolomyces roseus)。

［1］石磊，邊炳鑫，趙由才，等.城市生活垃圾衛(wèi)生填埋場(chǎng)惡臭的防治技術(shù)進(jìn)展 ［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2005，6(2).

［2］單奇華，俞元春，傅利劍，等.除臭酵母的篩選及其除臭機(jī)理［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，29(4).

［3］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) (第3版) ［M］.北京:高等教育出版社，1999.

［4］胡開輝.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:中國(guó)林業(yè)出版社，2004.

［5］吳小平，鄭耀通.除臭微生物的篩選［J］.福建輕紡，2002，(1).

［6］陳彬，魯緋，王夫杰，等.醬油增香發(fā)酵用耐鹽酵母菌的生理生化特性分析及菌種鑒定 ［J］.中國(guó)釀造，2010，(11).

［7］徐軍，羅惠波，崔德寶，等.大曲中酵母菌的分離及其鑒定［J］.釀酒，2008，35(3).

［8］ 趙斌，何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) ［M］.北京:科學(xué)出版社，2002.