三聚氰酸和三聚氰胺對肉雞生長性能的影響及其組織殘留的研究

王 亮 丁雪梅 張克英 白世平 吳彩梅

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所,教育部抗病營養(yǎng)重點實驗室,雅安 625014)

三聚氰酸(cyanuric acid,CYA)和三聚氰胺(melam ine,MEL)是 2種有機合成原料,均不得用作食品和單胃動物飼料添加劑。但是飼料原料生產(chǎn)過程中使用的肥料(如雙縮脲)、藥物(環(huán)丙氨嗪)可在動植物體內(nèi)代謝產(chǎn)生 MEL及其同系物,而 MEL也可能通過環(huán)境、包裝材料進入食品或飼料中[1-2];另外,CYA和 MEL氮含量較高[3],可提高凱氏定氮法測定的飼料中粗蛋白質(zhì)的含量,不法分子乘機牟取暴利。調(diào)查研究表明,MEL和CYA聯(lián)合毒性是美國“寵物中毒”事件和中國“三鹿奶粉”事件的元兇[4]。2008年 10月,香港發(fā)生的雞蛋中檢出 MEL事件,將 MEL及其同系物污染事件的影響蔓延至畜產(chǎn)品生產(chǎn)及加工行業(yè),引起人們對畜產(chǎn)品安全問題的加倍關(guān)注。同年,中國農(nóng)業(yè)部開展了畜禽及寵物飼糧中 MEL限量專項研究。本課題組研究了肉雞飼糧中添加高(250～2 000mg/kg)[5]、低(2～100mg/kg)[6]劑量 MEL及CYA(3.3～33.3mg/kg)與 MEL(10～100mg/kg)按一定比例(1∶3)聯(lián)合添加對肉雞生長性能和健康的影響。但目前的研究多是單獨添加 MEL對畜禽生長及健康的影響,有關(guān)其同系物 CYA以及二者聯(lián)合添加的相關(guān)研究并不多見。本試驗在前人研究基礎(chǔ)上進一步研究飼糧不同 CYA水平及與 MEL聯(lián)合添加對肉雞生長性能的影響及其在肉雞體內(nèi)的殘留,為全面評估 CYA及與 MEL的聯(lián)合毒性提供參考依據(jù),為食品安全風險評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

MEL,分析純,含量≥99.5%,購自北京化學試劑公司;CYA,化學純,含量≥98%,購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗設(shè)計及飼糧

本試驗采用 2×5兩因子隨機區(qū)組試驗設(shè)計,CYA設(shè) 5個水平：0、10、20、33.3和 50 mg/kg,MEL設(shè) 2個水平：0和 100 mg/kg。共 10個處理,每個處理 6個重復,每個重復 20只雞。

基礎(chǔ)飼糧為玉米 -豆粕型飼糧,參考 NRC(1994)肉雞飼養(yǎng)標準并結(jié)合中國飼養(yǎng)標準(NY/T 33—2004)配制,分為 1～21和 22～42 d 2個階段,所有飼糧均為粉料。所用玉米、豆粕、DL-蛋氨酸以及配合飼料經(jīng)分析均未檢出 CYA和 MEL。各階段基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 1。

表 1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets(air-dry basis) %

1.3 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗選用 1 200只 1日齡健康肉雞公雛,品種為科寶 500,在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所試驗場進行。肉雞采用網(wǎng)上平養(yǎng),1日齡雛雞按初始體重無差異原則隨機分入各個處理,紅外燈保溫。采用連續(xù)光照,自由采食和飲水。參照常規(guī)免疫程序進行免疫接種。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能

分別于試驗的第 1、22和 43天以重復為單位稱重,稱重前 12 h斷料。計算各階段體重、體增重、平均日采食量和料重比。

1.4.2 養(yǎng)分表觀利用率

生長試驗結(jié)束后,各重復選 1只健康、接近平均體重的試雞單籠飼養(yǎng),自由采食和飲水,采用全收糞法進行代謝試驗。預飼2 d,收集所有排泄物 4 d,剔除毛屑雜物,-20℃保存。試驗結(jié)束混勻 4 d內(nèi)收集的排泄物,65℃烘干,充分回潮,粉碎后測定飼糧及糞中粗蛋白質(zhì)、總能、鈣和磷含量,計算養(yǎng)分表觀利用率。計算公式如下：

養(yǎng)分表觀利用率(%)=[1-(糞中養(yǎng)分含量 ×風干糞樣重量)/(飼糧養(yǎng)分含量 ×采食量)]×100。

1.4.3 血漿、組織中 CYA及 MEL的殘留

樣品采集：分別于試驗第 22和 43天,每個重復挑選1只健康、接近平均體重的試雞,翅下采血5m L,注入含有肝素鈉的無菌離心管中,3 000 r/min離心10min,分離血漿。放血屠宰后分離肝臟和腎臟,統(tǒng)一取右側(cè)胸肌(50 g左右),-20℃保存,采用LC-MS/MS法測定 CYA和 MEL殘留。

測定方法：參考 Qiu等[7]動物組織中 CYA和MEL含量的測定方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 13.0的 GLM程序?qū)?shù)據(jù)進行兩因子方差分析,每個重復為 1個試驗單元,處理效應包括 CYA和 MEL水平以及二者的互作效應;血漿、組織中的 CYA和 MEL殘留采用單因素方差分析。以 P＜0.05作為各項數(shù)據(jù)差異的顯著性水平,采用Duncan氏法比較各處理平均值間差異顯著性。所有結(jié)果采用“平均值 ±標準差”形式表示。

2 結(jié) 果

2.1 CYA和/或 M EL對肉雞生長性能的影響

飼糧添加 CYA和/或 MEL對肉雞生長性能的影響見表 2。飼糧中添加 10～50mg/kg CYA對肉雞 21 d體重、1～21 d體增重和平均日采食量有不利影響;CYA與 100 mg/kg MEL聯(lián)合添加對肉雞的生長性能無顯著交互作用(P＞0.05)。

2.2 CYA和/或 MEL對肉雞養(yǎng)分表觀利用率的影響

CYA和/或 MEL對肉雞養(yǎng)分表觀利用率的影響見表 3。CYA對肉雞飼糧粗蛋白質(zhì)、磷、鈣表觀利用率無顯著影響(P＞0.05),50mg/kg CYA的處理總能表觀利用率與對照組差異顯著(P＜0.05),CYA與 100mg/kg MEL聯(lián)合添加對肉雞養(yǎng)分表觀利用率無顯著交互作用(P＞0.05)。

2.3 CYA和 MEL在肉雞血漿、組織中的殘留

表 4、表 5顯示,對照組各組織中均未檢出CYA;其余各處理在肌肉和肝臟中未檢出 CYA,但在血漿和腎臟中檢出 CYA,其中腎臟中殘留量最高。各處理血漿 CYA殘留量無顯著差異(P＞0.05),腎臟 CYA殘留量以 CYA單獨添加 33.3和50mg/kg的處理最高,并且顯著高于單獨添加 10和 20 mg/kg的處理(P＜0.05);CYA與 MEL聯(lián)合添加未進一步增加組織中 CYA殘留量。

未添加 MEL的處理血漿中均未檢出 MEL,但在肌肉、肝臟、腎臟組織中均檢出微量 MEL;添加MEL的各處理在肌肉、肝臟和腎臟均檢出 MEL,且肌肉和腎臟中殘留量極顯著高于未添加 M EL的處理(P＜0.01);CYA與 MEL聯(lián)合添加的處理肝臟和腎臟中 MEL殘留量顯著高于單獨添加MEL的處理(P＜0.05)。

3 討 論

3.1 CYA和/或 MEL對肉雞生長性能的影響

美國食品藥品管理局(FDA)調(diào)查研究指出,CYA和 MEL均屬低毒性物質(zhì),只有長期大量服用或注射才會損害生殖、泌尿系統(tǒng),進而引起食欲不振、精神萎靡、死亡率上升等癥狀[8-9]。Gao等[10]研究表明,飼糧中添加 2～100mg/kg MEL并未導致蛋鴨精神萎靡、死亡率上升等,但有降低產(chǎn)蛋性能的趨勢。丁雪梅等[6]、Lv等[11]研究表明,單獨添加 2～100 mg/kg MEL對肉雞生產(chǎn)性能并無顯著不利影響。本試驗單獨添加 0～50 mg/kg CYA或與 100mg/kg MEL聯(lián)合添加,未發(fā)現(xiàn)肉雞出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、死亡率高等不良反應,與前人的研究結(jié)果一致。但添加 10～50 mg/kg CYA或100 mg/kg MEL會降低 21 d體重和 1～21 d體增重,具有一定的 CYA劑量效應;但在 22～42 d無相應趨勢,表明 CYA及 MEL對幼齡肉雞生長可能有一定的不利影響。CYA與 MEL聯(lián)合添加未進一步降低肉雞生長性能,其原因可能是本試驗中 CYA和 MEL的添加劑量相對于前人研究(250 mg/kg)[5,8]較低。

表 2 CYA和/或M EL對肉雞生長性能的影響Table 2 Effects of CYA and/or MEL on grow th performance of broilers

表 3 CYA和/或M EL對肉雞養(yǎng)分表觀利用率的影響Table 3 Effects of CYA and/or MEL on apparent nutrientavailability of broilers

表 4 CYA在肉雞血漿、組織中的殘留Table 4 CYA residues in p lasma and tissues of broilers

表 5 MEL在肉雞血漿、組織中的殘留Table 5 MEL residues in p lasma and tissues of broilers

CYA和 MEL對畜禽養(yǎng)分利用率的影響尚未見報道。世界衛(wèi)生組織(WHO)及 FDA的調(diào)查報告中指出,CYA和 MEL的聯(lián)合毒性是系列中毒事件的源頭[4],但有關(guān)二者聯(lián)合比例的研究尚不多見。Xu等[12]研究中指出,CYA和 MEL不只存在 1∶1的結(jié)合方式,還存在 1∶3的結(jié)合方式,說明 CYA和MEL的結(jié)合方式并不單一,但是否影響毒性還需進一步研究。本試驗中,單獨添加低劑量的 CYA以及 CYA與 MEL聯(lián)合添加對粗蛋白質(zhì)、總鈣和總磷的表觀利用率均沒有顯著影響。但與對照組相比,50mg/kg CYA顯著降低總能的利用率(P＜0.05),33.3mg/kg CYA單獨或與100mg/kg MEL聯(lián)合添加對總能利用率也有不利影響;但 10～20 mg/kg CYA與 100mg/kg MEL聯(lián)合添加并未影響總能利用率。

3.2 CYA和 MEL在組織中的殘留

CYA和 MEL在食品中的蓄積已經(jīng)成為當前國際食品安全領(lǐng)域重點關(guān)注的問題之一。2008年“三鹿奶粉”事件之后,中國衛(wèi)生部等 5部門公布奶粉及乳制品中 MEL限量值為 2.5mg/kg,并明令禁止人為添加,該限量也得到了 WHO的認可。2009年6月,農(nóng)業(yè)部頒布的《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1218號》規(guī)定,MEL是工業(yè)原料,禁止人為添加,但可能通過環(huán)境、包裝材料等混入,為保證養(yǎng)殖動物及其產(chǎn)品安全,飼料原料和飼料產(chǎn)品中 MEL的限量值為 2.5mg/kg。但其他食品中 MEL以及 CYA的限量值尚未有規(guī)定。有研究報道,飼糧中的 CYA和 MEL會在動物組織中殘留,以腎臟中為最高[13-14]。但關(guān)于二者聯(lián)合添加對殘留量影響的研究結(jié)果并不一致。Lv等[15]比較了飼喂添加 MEL和/或 CYA飼糧的羔羊組織中 MEL和 CYA的殘留量,研究表明,羔羊組織中 MEL的殘留量與是否添加 CYA無關(guān)。但 Reimshuessel等[16]分別以魚、豬、貓等作為研究對象得出,MEL和 CYA聯(lián)合添加會影響二者在魚組織中的殘留量。造成該差異的原因可能與動物的種屬差異有關(guān)。另外,Seffernick等[17]報道,MEL在微生物作用下會發(fā)生一系列的變化而形成其同系物(如 CYA)或者結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì),而這種反應很有可能在胃腸道或者其他部位的微生物群落的作用下發(fā)生。本試驗表明,飼糧中添加10～50mg/kg CYA可在肉雞血漿和腎臟中檢測到殘留,隨添加劑量增加,腎臟中殘留量也增加;單獨添加 MEL 100 mg/kg也會有 CYA殘留,可能是MEL在胃腸道微生物的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化,生成了CYA;MEL并不影響 CYA的殘留量,其機理有待進一步研究。未添加 MEL處理的肉雞血漿中并無MEL殘留,可能是 MEL含量低且在血漿中半衰期較短,采樣前 12 h斷料后已代謝出血漿;未添加MEL的處理肉雞組織中均檢出微量 MEL,其來源尚不清楚,可能是飼料原料中的環(huán)丙氨嗪在肉雞體內(nèi)的代謝產(chǎn)物或者是添加 CYA的處理在胃腸道微生物的作用下發(fā)生了轉(zhuǎn)化。添加 MEL 100 mg/kg可顯著增加其在肉雞組織中的殘留;CYA與MEL聯(lián)合添加未進一步增加組織中 CYA殘留量,但可極顯著增加 MEL在肌肉、腎臟組織的殘留;與單獨添加 MEL相比,聯(lián)合添加還顯著增加了肝臟和腎臟中 MEL的殘留。此外,CYA與 MEL的比例影響MEL在組織中的殘留量,腎臟 M EL殘留量以 CYA與 MEL比例為 1∶3時最高,而肝臟中 MEL殘留量以 CYA與 MEL比例為 1∶5時最高,可能與二者比例影響其在體內(nèi)的代謝和排泄方式有關(guān),因而對肝臟和腎臟的損傷不同。但為何 CYA與 MEL聯(lián)合添加會增加組織中 MEL殘留量的機理有待進一步研究。

4 結(jié) 論

①本試驗條件下,飼糧中添加 10～50 mg/kg CYA對幼齡肉雞生長性能有不利影響,50 mg/kg CYA顯著降低總能表觀利用率。

② 10～50 mg/kg CYA、100mg/kg MEL及二者聯(lián)合添加均會導致肉雞組織中 CYA和 MEL殘留,二者聯(lián)合添加增加 MEL在肉雞組織中的殘留量,其比例影響 MEL的殘留量。

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