飼糧硒對種公雞睪丸中硒含量和硒蛋白酶基因 mRNA表達的影響

趙 慶 劉愛巧 王曉霞 張 潔 劉亭婷

(1.北京農(nóng)學院動物科學技術學院,北京 102206;2.北京華都峪口禽業(yè)有限公司,北京 101206;3.首都師范大學,北京 100048;4.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院畜牧獸醫(yī)系,北京 102442)

硒是動物必需的一種微量元素,對維持機體生命活動及生長發(fā)育必不可少。硒以硒半胱氨酸形式通過 UGA密碼子編碼形成硒蛋白,與機體的抗氧化作用、免疫應答及內(nèi)分泌功能密切相關,直接影響動物的生長、發(fā)育和繁殖[1]。對雄性動物的研究發(fā)現(xiàn),以硒半胱氨酸為中心的抗氧化酶系能消除體內(nèi)代謝過程產(chǎn)生的過多的自由基,促進睪丸發(fā)育,提高精液品質(zhì)[2-3]。硒缺乏會導致硒蛋白酶活性的顯著降低,其中包括硫氧還蛋白還原酶家族(TrxRs)、谷胱甘肽過氧化物酶家族(GPxs)和脫碘酶家族(IDs)。然而,在硒缺乏和充足時,硒蛋白的表達呈現(xiàn)出等級現(xiàn)象,在特定器官中根據(jù)某種硒蛋白的重要性可以決定其基因mRNA的相對表達水平和蛋白表達的優(yōu)先性[4]。在硒缺乏的情況下,肝、腎和肺中的大部分硒蛋白酶活性下降,而在大腦中的硒蛋白酶活性仍然處在一個正常硒供給情況下的水平。當然硒過量也會引起動物中毒,在生產(chǎn)中需按照“適量為必須,超量則中毒”的原則添加。種公雞營養(yǎng)狀況、飼養(yǎng)管理水平以及人工授精技術等均會影響其精液品質(zhì)和繁殖性能,但是有關種公雞的營養(yǎng)研究報道較少。關于飼糧中添加硒對種公雞睪丸組織生理功能的影響,其硒的吸收與硒蛋白酶基因 mRNA相對表達水平的關系如何,目前鮮見報道。本文旨在通過對海蘭褐種公雞飼糧進行不同來源和水平的硒處理,研究飼糧硒對種公雞睪丸組織硒沉積和硒蛋白酶基因 mRNA相對表達水平的影響以及二者之間的關系,為進一步研究其分子機理及指導生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

亞硒酸鈉(sodium selenite,SS)購自黃驊市津華添加劑有限公司,硒含量為 44.7%;酵母硒(selenium yeast,SY)購自安琪酵母股份有限公司,硒含量為 2 000 mg/kg。Trizol購自 Invitrogen公司,Depc購自 Sigma公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV)購自 Invitrogen公司,Real-time試劑盒購自 Takara公司。硝酸、鹽酸、過氯酸和氫溴酸均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗設計與飼糧

2010年 3月于北京農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院種雞場選取 224只 48周齡海蘭褐蛋用種公雞為試驗動物,平均體重為(3 000.14±123.71)g,隨機分為7個處理,每個處理 4個重復,每個重復 8只,單籠飼養(yǎng)。將 SY和 SS 2種硒源分別以 0.2、0.5和0.8mg/kg 3個硒水平添加到種公雞基礎飼糧中,所有組均飼喂基礎飼糧 1周后,開始飼喂相應的試驗飼糧(對照組飼喂基礎飼糧),正試期 35 d。依照海蘭褐蛋用種公雞飼養(yǎng)管理規(guī)程進行飼養(yǎng)管理,自由飲水和人工喂料,每天按規(guī)程要求清掃地面、糞便和帶雞噴霧消毒。整個試驗在北京農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院種雞場進行。于試驗第 35天,每個重復隨機取 1只雞翅靜脈采血,制備血漿,并于試驗結(jié)束后,每個重復隨機取 1只雞宰殺,取其睪丸樣。

本試驗采用玉米 -豆粕型飼糧,參考美國NRC(1994)禽類營養(yǎng)標準配制?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 1。

表 1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

1.3 睪丸中硒含量的測定

睪丸中硒含量按照 GB/T 12399—1996硒含量測定方法測定。

1.4 血漿中谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性的測定

使用南京建成工程研究所提供的試劑盒測定血漿中 GPx活性。

1.5 睪丸中硒蛋白酶基因 m RNA相對表達水平的測定

1.5.1 引物設計與合成

根據(jù) GenBank公布的雞基因序列設計引物見表2,引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

表 2 RT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences for RT-PCR

1.5.2 實時熒光定量 PCR(RT-PCR)

睪丸組織總 RNA提取采用 Trizol法,對所提取 RNA進行檢測,以 OD260/OD280和OD260/OD230值判斷 RNA樣品中有無污染,以甘油醛 -3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為相對定量內(nèi)參,按照 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA第 1鏈,PCR使用條件為：預變性 94℃ 10 s,變性 94℃ 5 s,退火 /延伸60℃ 34 s,共 40個重復。采用 2-△△Ct法分析碘化甲腺氨酸脫碘酶 1(ID1)、磷脂谷胱甘肽過氧化物酶(GPx4)和硫氧還蛋白還原酶 2(TrxR2)基因mRNA相對表達水平。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均以平均值 ±標準差表示,應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析,差異顯著者用 Oneway ANOVA比較各組間相關指標的差異;用Two-way ANOVA檢驗硒源和硒水平對睪丸硒沉積的主效應及兩者間的交互效應。

2 結(jié) 果

2.1 RNA凝膠電泳

圖 1是 RNA提取后的瓊脂糖凝膠電泳圖,由此圖可以看出,5S、18S和 28S條帶明顯,這說明提取的 RNA的完整性良好,可以用來進行反轉(zhuǎn)錄和 PCR的擴增。

2.2 飼糧硒源和硒水平對種公雞睪丸中硒含量的影響

由表 3可見,硒源和硒水平對種公雞睪丸中硒含量均有顯著影響(P＜0.01),而硒源和硒水平之間的交互作用對睪丸中硒含量沒有顯著影響(P＞0.05)。添加 SS的組和添加 SY的組種公雞的睪丸中硒含量分別較對照組高 19.38%(P＜0.01)和 28.29%(P＜0.01),且添加 SY的組種公雞的睪丸中硒含量較添加 SS的組高 7.47%(P＜0.01)。

圖 1 總 RNA凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis resultof total RNA sam ple

2.3 飼糧硒源和硒水平對種公雞血漿中 GPx活性的影響

表 4表明,與對照組相比,0.5 mg/kg SS組種公雞血漿中 GPx活性提高了 9.80%(P＜0.05),0.5 mg/kg SY組和 0.8 mg/kg SY組種公雞血漿中 GPx活性分別提高了 11.67%(P＜0.05)和16.98%(P＜0.05)。

2.4 飼糧硒源和硒水平對種公雞睪丸中硒蛋白酶基因m RNA相對表達水平的影響

RT-PCR方法研究 ID1、GPx4和 TrxR2基因mRNA相對表達水平,結(jié)果見表 5。

各組種公雞睪丸中 ID1基因 mRNA相對表達水平差異均不顯著(P＞0.05)。

關于種公雞睪丸中 GPx4基因 mRNA相對表達水平,以 SS為硒源時,3個水平組均顯著高于對照組,分別提高了 1.36%(P＜0.01)、13.33%(P＜0.01)和 8.34%(P＜0.01),但 3組之間差異不顯著(P＞0.05);以 SY為硒源時,3個水平組均顯著高于對照組,分別提高了 11.06%(P＜0.01)、15.41%(P＜0.01)和 19.95%(P＜0.01),且0.8 mg/kg SY組比 0.2 mg/kg SY組高8.00%(P＜0.01)。

表 3 飼糧硒源和硒水平對種公雞睪丸中硒含量的影響Table 3 Effects of dietary selenium source and level on selenium content in the testis of breeder cocks mg/kg

表 4 飼糧硒源和硒水平對種公雞血漿中GPx活性的影響Table 4 Effects of dietary selenium source and levelon GPx activity in the p lasma of breeder cocks

關于種公雞睪丸中 TrxR2基因 m RNA相對表達水平,以 SS為硒源時,3個水平組均顯著高于對照組,分別提高了 15.49%(P＜0.01)、19.39%(P＜0.01)和 21.24%(P＜0.01),且 0.8 mg/kg SS組比 0.2mg/kg SS組高 4.98%(P＜0.05);以SY為硒源時,3個水平組均顯著高于對照組,分別提高了 17.16%(P＜0.01)、19.94%(P＜0.01)和 23.84%(P＜0.01),且 0.8 mg/kg SY組比0.2 mg/kg SY組高 5.70%(P＜0.01)。

3 討 論

微量元素硒有無機硒和有機硒 2種形式,通常情況下組織更容易吸收有機硒,無機硒被組織吸收很少[5]。生產(chǎn)中為了滿足畜禽對硒的需要量,通常在飼糧中添加一定量的外源硒。組織硒沉積依賴于組織特異性、食物中有效硒含量、飼喂時間長短、動物品種和年齡及硒的化學形式。本試驗結(jié)果表明,飼糧中添加 SS和 SY均能顯著提高睪丸組織硒沉積,且 SY處理顯著優(yōu)于 SS處理。說明有機硒的機體利用率高于無機硒,這與Danny[6]以 SY形式向母豬飼糧中添加有機硒的結(jié)果一致,以 SY形式提供的硒的生物學利用率高于SS形式提供的硒。

表 5 飼糧硒源和硒水平對種公雞睪丸中硒蛋白酶基因 mRNA相對表達水平的影響Table 5 Effects of dietary selenium source and levelon the mRNA relative expression levelof selenium protease gene in the testis of breeder cocks

GPx是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶,是反映機體抗氧化能力的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn),對于提高種公雞血漿中 GPx活性,飼糧中添加 SY較添加 SS的效果更顯著。這與占秀安等[7]的有機硒(硒代蛋氨酸)對母豬抗氧化指標影響的研究結(jié)果是一致的,有機硒生物學效率優(yōu)于無機硒。但 Manhan等[8]在育肥豬上的研究表明,添加 SS較添加 SY能顯著提高血清中 GPx活性。推測這可能與動物種屬和性別等原因有關。本試驗表明有機硒可能更利于硒在種公雞體內(nèi)被轉(zhuǎn)化利用。

微量元素硒與雄性動物生殖器官有很強的親和性,并依賴其機體主要存在形式硒蛋白發(fā)揮其生物學功能。Smith等[9]用放射性同位素的方法研究測定了公牛多種器官中硒的分布狀況,發(fā)現(xiàn)除腎外,以睪丸、附睪、前列腺、精囊腺組織中的含量最高,這表明硒與動物生殖密切相關。IDs是一類細胞膜硒蛋白酶,主要功能是調(diào)節(jié)機體甲狀腺激素的水平。Beckett等[10]發(fā)現(xiàn)大鼠營養(yǎng)性硒缺乏導致血漿三碘甲腺原氨酸(T3)水平顯著下降、四碘甲腺原氨酸(T4)水平顯著升高和肝臟 ID1活性顯著下降。原位雜交法表明 GPx4在末期精細胞中豐富表達[11]。Ursini等[12]研究 GPx4在精子發(fā)育的早期具有酶活性,而在精子成熟期則聚合變構(gòu)轉(zhuǎn)變成一種結(jié)構(gòu)成分,維持精子正常的形態(tài)和活力。這表明 GPx4在精子發(fā)育成熟和活力維持中具有酶功能和結(jié)構(gòu)作用的雙重性。TrxR可清除過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物,其清除效率甚至高于 GPx,對維持細胞內(nèi)還原狀態(tài)非常重要。這表明飼糧硒通過機體合成硒蛋白酶,后者在體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。在哺乳動物細胞中,控制mRNA的相對表達水平是調(diào)控蛋白生成的關鍵因素。關于硒蛋白酶基因的表達,體內(nèi)硒含量是其重要的調(diào)控因素。硒的營養(yǎng)狀況可影響硒蛋白酶生成量及其基因 mRNA的相對表達水平[13]。Diane等[14]的研究結(jié)果顯示,缺硒能使大鼠腎臟 ID1基因 mRNA的相對表達水平降低 40%,而對肝臟ID 1基因 mRNA的相對表達水平?jīng)]有影響;但潘翠玲[15]研究發(fā)現(xiàn)富硒益生菌能夠顯著提高蛋雞肝臟組織中 ID1基因 m RNA的相對表達水平;本試驗添加硒對種公雞睪丸組織中 ID1基因 mRNA的相對表達水平?jīng)]有顯著影響。以上結(jié)果表明,硒對組織中 ID1基因 mRNA的表達存在組織差異性和種屬特異性,可能還與其他一些未知的因素有關,有待于進一步研究。X in等[16]和 Kevin等[17]研究了不同硒水平的 SS對大鼠肝臟 GPx1基因mRNA表達的影響,結(jié)果表明不同硒水平不影響GPx1基因 mRNA的生成量,但影響 mRNA的穩(wěn)定性,大鼠體內(nèi)硒缺乏時,GPx1基因 m RNA穩(wěn)定性降低,GPx1基因 mRNA的相對表達水平也隨之降低。X in等[18]用添加0.3 mg/kg硒的飼糧飼喂豬,結(jié)果表明豬的肝臟和睪丸中的 GPx4活性變化規(guī)律是一致的：對睪丸組織而言,1日齡和 28日齡時的 GPx4基因 mRNA相對表達水平顯著地小于180日齡;對肝臟組織而言,28日齡和 180日齡時的 GPx4基因 m RNA相對表達水平?jīng)]有顯著差異,但都顯著地大于 1日齡時GPx4基因 mRNA的相對表達水平。Lei等[19]將大鼠飼糧中硒水平由2μg/kg上升到 190μg/kg時,睪丸中 GPx4基因mRNA的相對表達水平不受飼糧硒水平的影響。關于 GPx4基因 mRNA的相對表達水平報道不一致的原因,推測可能是動物硒蛋白酶基因的表達可能存在組織和時間的差異性,其作用機制有待于進一步探討。本試驗結(jié)果顯示,以 SS為硒源時,不同添加水平的 SS組顯著高于對照組,但各水平組之間 GPx4基因 mRNA的相對表達水平差異不顯著,且當添加水平為 0.8 mg/kg時,其相對表達水平有下降趨勢;以 SY為硒源時,不同添加水平的 SY組 GPx4基因 mRNA的相對表達水平顯著高于對照組,且0.8mg/kg組顯著高于0.2 mg/kg組。這與上述等研究結(jié)果不一致,可能是種公雞睪丸組織中 GPx4基因 mRNA的相對表達水平與不同硒源和水平有關,也與種屬特異性有關。Jurado等[20]檢測百草枯應激小鼠不同組織中 TrxR基因 mRNA的相對表達水平時發(fā)現(xiàn),其睪丸、脾和腎組織中 TrxR基因 mRNA相對表達水平均有不程度提高,其中睪丸中顯著提高。但是TrxR基因 mRNA的相對表達水平的提高不一定是 TrxR蛋白水平提高的直接信號。本試驗研究飼糧添加硒對種公雞睪丸組織中 TrxR 2基因mRNA相對表達水平的影響,其規(guī)律與本試驗研究結(jié)果的飼糧添加硒對睪丸組織中 GPx4基因mRNA相對表達水平的影響基本一致,結(jié)果表明飼糧中添加硒可以顯著提高睪丸組織中 TrxR2基因m RNA的相對表達水平。有關硒蛋白酶在睪丸組織中的相對表達水平和活性與硒蛋白酶基因m RNA的相對表達水平的關系有待進一步研究。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下,飼糧中添加 SY可增強種公雞抗氧化功能,添加 0.8 mg/kg SY效果較好。

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