細胞周期素D1在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達及意義

邢勁松 史培榮 陳顯久 何東寧 李麗華 南欣榮

（1.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院 口腔科；2.山西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學系 口腔頜面外科教研室，太原 030001）

細胞周期素D1在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達及意義

邢勁松1史培榮2陳顯久2何東寧2李麗華2南欣榮2

（1.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院 口腔科；2.山西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學系 口腔頜面外科教研室，太原 030001）

目的 研究口腔鱗狀細胞癌（OSCC）組織中細胞周期素D1（Cyclin D1）的表達及意義。方法 應用免疫組織化學Envosion法檢測50例OSCC患者與10例正常黏膜組織中Cyclin D1蛋白在病理組織切片中的表達水平，并進行統(tǒng)計學分析。結果 在50例OSCC標本中Cyclin D1主要表達在細胞核，也有少量表達在細胞漿。Cyclin D1在OSCC標本中的陽性表達率80.0%，明顯高于在正?？谇火つそM織中的表達率20.0%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。Cyclin D1表達與OSCC病理分級、臨床分期和是否有淋巴結轉移密切相關（P<0.05）。結論 Cyclin D1蛋白的異常表達與OSCC的發(fā)生、發(fā)展有密切的關系，可作為OSCC治療和預后的輔助性指標。

口腔鱗狀細胞癌； 細胞周期素D1； 免疫組織化學

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）在口腔頜面部惡性腫瘤中最為常見，其發(fā)生與抑癌基因的表達有密切的關系。近年來的研究表明：抑癌基因參與細胞的信號傳導系統(tǒng)，在正常情況下對DNA的復制、細胞的生長和增殖起著監(jiān)控作用，它們在基因水平上的突變和因此導致其編碼蛋白質功能的喪失是腫瘤細胞生長失控的重要原因。在細胞周期調控中，細胞周期素D1（Cyclin D1）是細胞周期中G1期進入S期的重要調控因子，G1→S期間調控點是細胞內外信號傳遞，整合匯集到細胞核，對細胞的增殖進行調控的關鍵點，該點調控的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。關于Cyclin D1蛋白在口腔鱗癌組織中表達的臨床意義國內外尚未見報道。本實驗采用免疫組織化學Envosion法對Cyclin D1蛋白在口腔鱗癌組織的表達進行了檢測，探討其與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的關系，并分析其與口腔鱗癌臨床病理參數(shù)的關系，以探討Cyclin D1在口腔鱗癌癌變過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 標本來源

OSCC標本取自山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院病理科2005年1月—2009年12月存檔蠟塊，共50例，其中唇癌10例，舌癌12例，頰癌10例，牙齦癌10例，口底癌8例；男性35例，女性15例；年齡最大76歲，最小20歲，平均年齡49.5歲；高分化鱗癌18例，中分化鱗癌15例，低分化鱗癌17例。按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2002年TNM分類及分期標準對50例口腔鱗狀細胞癌標本進行TNM分類和臨床分期，其中T1期7例，T2期15例，T3期15例，T4期13例；伴頸淋巴結轉移20例。選取10例正常口腔黏膜組織做為對照，其中男性6例，女性4例，平均年齡42.5歲。實驗組病例納入標準為：要求均為首次治療病例；2位病理科專家檢查共同證實確為OSCC病例；有完整記錄。實驗組病歷排除標準為：復發(fā)后入院病例；術前接受過放化療治療的OSCC病例。

1.2 主要試劑

一抗兔抗人Cyclin D1單克隆抗體，由福州邁新生物技術開發(fā)有限公司提供；二抗PV-6000由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.3 實驗方法

標本切片，厚度為3～5μm，應用免疫組織化學試劑盒（Envision PV-6000 PowerVisionTM）二步法進行染色。所有標本常規(guī)脫蠟、脫水，PBS洗滌3次，每次2min。Cyclin D1抗體采用高壓鍋熱修復15min，自然冷卻20～30min，PBS洗滌2min3次，每次2min。滴加兔抗人Cyclin D1單克隆抗體（工作濃度為1∶25），4℃冰箱過夜。室溫下放置15～20min后PBS洗滌3次，每次2min。滴加二抗PV-6000，37℃孵育20 min后溫室繼續(xù)孵育10min，PBS洗滌3次，每次2min；DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。已知陽性的OSCC組織標本作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。免疫組織化學染色以細胞質或細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。每張切片隨機選取10個高倍視野（×400），記錄1 000個細胞中陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞數(shù)。根據(jù)每一切片的染色細胞比例及染色強度分為4種：陰性（-）為未見棕黃色顆粒；弱陽性（+）為陽性細胞數(shù)＜25%；中度陽性（++）為陽性細胞數(shù)25%～75%；強陽性（+++）為陽性細胞數(shù)＞75%。

1.4 統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)結果使用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，采用χ2檢驗、確切概率法（Fisher法）及Spearman秩相關統(tǒng)計學方法進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

在50例OSCC組織中Cyclin D1主要表達在細胞核，也有少量表達在細胞漿，結果見圖1。

圖1 Cyclin D1在OSCC組織中的表達 Envision ×250Fig 1 Cyclin D1 expression in OSCC tissue Envision ×250

在OSCC組織中的表達率為80.0%，明顯高于在正?？谇火つそM織中的表達率20.0%（P<0.01），說明Cyclin D1參與了口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生和發(fā)展。隨著OSCC惡性程度的增加，Cyclin D1表達隨之增高：高分化OSCC組織有38.9%的表達，中分化OSCC組織有66.7%的表達，低分化OSCC組織有88.2%的表達，差異有顯著性（P<0.01）；低分化OSCC組織Cyclin D1表達率顯著高于高分化組織（P<0.05），說明Cyclin D1陽性表達與OSCC組織分化程度有關。臨床T1期OSCC組織Cyclin D1陽性表達率為42.9%，臨床T2期OSCC陽性表達率為66.7%，臨床T3期OSCC陽性表達率為86.7%，臨床T4期OSCC陽性表達率為92.3%，差異有顯著性（P<0.05）；同時，T4期Cyclin D1的表達顯著高于T1期（P<0.05）。有淋巴結轉移的OSCC組織中Cyclin D1蛋白表達水平明顯高于無淋巴結轉移者（P< 0.01）。上述結果提示：OSCC的發(fā)生與細胞周期有關，Cyclin D1陽性表達與OSCC組織分化程度、臨床分期、是否有淋巴結轉移密切相關，間接說明Cyclin D1的陽性表達與OSCC患者的愈后可能有關（表1）。

表1 Cyclin D1在OSCC組織中的表達Tab 1 Cyclin D1 expression in OSCC tissue

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多階段、多基因參與的復雜過程。OSCC是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，約占口腔頜面部惡性腫瘤的80%，其發(fā)病因素與煙酒等不良嗜好、環(huán)境污染、機械刺激及生物學因素等有關，并涉及多個基因的改變[1]。

報道顯示：Cyclin D1基因定位于染色體11q13[2]，長約120 kb，基因跨距約15 kb，含有5個外顯子，編碼295個氨基酸構成的蛋白質，相對分子質量為34 000[3]，是與細胞周期中G1期調控有關的蛋白，被認為是癌基因[4]，在細胞周期進程中，其含量受到生長因子等因素的調控，呈周期性變化。細胞周期向前發(fā)展是在細胞周期調控因子，即細胞周期蛋白家族和細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）形成復合物后共同作用引起的[5-6]。Cyclin D1是細胞周期蛋白家族中的重要一員，它與相應的CDK4或CDK6結合，形成Cyclin 2/CDK復合物，激活Rb蛋白，啟動細胞S期相關基因的轉錄，使細胞進入自主分裂增殖程序。導致CDK激酶活化，使細胞分裂由G1期進入S期[7]。當Cyclin D1擴增或過表達時，G1/S期縮短，促使細胞增殖，導致癌變。Cyclin D1的一個重要特點是其蛋白的過量表達與腫瘤的浸潤轉移有關。本研究結果顯示：正?？谇火つそM織中Cyclin D1蛋白有少量表達，在OSCC組織中表達明顯升高，提示Cyclin D1蛋白的表達發(fā)生在OSCC惡性轉化的早期，與OSCC的發(fā)生有關。

隨著對Cyclin D1研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)Cyclin D1不但與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，而且與腫瘤的轉移、預后也密切相關。Hameed等[8]利用免疫組織化學發(fā)現(xiàn)：發(fā)生轉移的乳頭狀甲狀腺癌患者中90.9% Cyclin D1蛋白過表達，而未發(fā)生轉移的患者中Cyclin D1蛋白過表達者僅為8.8%。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Cyclin D1蛋白過表達者的生存率明顯低于低表達者，提示其可作為有效預后因子[9-10]。本研究結果顯示：淋巴結轉移組Cyclin D1蛋白陽性表達率明顯高于無淋巴轉移組（P<0.05）；Ⅲ和Ⅳ期癌組織Cyclin D1蛋白陽性表達率高于Ⅰ和Ⅱ期（P<0.05）。提示Cyclin D1蛋白不但參與原位腫瘤形成過程的調節(jié)，促進其發(fā)展，可能還參與癌細胞轉移過程的調節(jié)，在轉移過程中發(fā)揮作用，可能是影響OSCC預后的重要分子生物學指標。

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（本文編輯 湯亞玲）

Expression and its significance of Cyclin D1 in oral squamous cell carcinoma

XING Jin-song1,SHI Pei-rong2,CHEN Xian-jiu2,HE Dong-ning2,LI Li-hua2,NAN Xin-rong2.（1.Dept.of Stomatology,The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan030001,China;2.Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,Dental Medical Department of Shanxi Medical University,Taiyuan030001,China）

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Cyclin D1 in oral squamous cell carcinoma（OSCC）.MethodsA immunohistochemistry method,Envosion,was employed to test the manifesting levels of Cyclin D1 in pathological slices of 50 OSCC cases and 10 normal cases,and the results was treated with statistical analysis.Results In 50 OSCC cases,Cyclin D1 mainly manifested in karyon,and a little in cytoplasm.The positive manifesting rates of Cyclin D1 in the samples was 80.0%,which was significantly higher than the manifesting rates of 20.0%in normal oral mucous membrane（P<0.01）.The manifestation of Cyclin D1 was correlated with the different pathological grades,clinical phases and lymph node metastasis（P<0.05）.ConclusionThe abnormal manifestation of Cyclin D1 is closely related with the occurrence and development of OSCC.Therefore,it can be used as subsidiary index for OSCC treatment and prognosis.

oral squamous cell carcinoma； Cyclin D1； immunohistochemistry

R 782.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.020

1000－1182（2011）03－0299-03

2010-09-09；

2010-12-10

山西省科技工業(yè)攻關基金資助項目（20090322028-1）

邢勁松（1974—），男，山西人，主治醫(yī)師，碩士

南欣榮，Tel：13903434186