正畸牙根吸收與齦溝液中牙本質(zhì)涎磷蛋白和牙本質(zhì)涎蛋白相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究

左志剛 胡敏 姜?dú)g 田莉

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 正畸科；2.吉林大學(xué) 分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130021）

正畸牙根吸收與齦溝液中牙本質(zhì)涎磷蛋白和牙本質(zhì)涎蛋白相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究

左志剛1胡敏1姜?dú)g1田莉2

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 正畸科；2.吉林大學(xué) 分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130021）

目的 探討大鼠齦溝液中牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）和牙本質(zhì)涎蛋白（DSP）的表達(dá)與實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)所致牙根吸收的關(guān)系。方法 36只健康Wistar大鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、輕力組、重力組。以上頜切牙為支抗，輕力組和重力組分別以0.392、0.98N力拉右側(cè)上頜第一磨牙向近中移動(dòng)。加力7 d后，提取齦溝液，制備實(shí)驗(yàn)牙及其牙周組織切片，行蘇木精-伊紅染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色觀察牙根吸收情況，并通過Western blot檢測(cè)齦溝液中DSPP、DSP的表達(dá)。結(jié)果 組織學(xué)觀察：對(duì)照組未見明顯的牙根吸收，輕力組未見明顯的牙根吸收及破牙骨質(zhì)細(xì)胞，重力組在根尖1/3遠(yuǎn)中區(qū)及根分叉附近出現(xiàn)明顯牙根吸收。Western blot結(jié)果顯示：對(duì)照組中只有DSPP表達(dá)，輕力組和重力組中有DSPP和DSP表達(dá)。3組大鼠齦溝液中DSPP、DSP蛋白的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），重力組中2種蛋白表達(dá)最高，輕力組次之，對(duì)照組最低。結(jié)論 在正畸所導(dǎo)致的牙根吸收過程中，齦溝液中有DSPP和DSP的表達(dá)。

牙根吸收； 齦溝液； 牙本質(zhì)涎磷蛋白； 牙本質(zhì)涎蛋白

牙根吸收是正畸牙移動(dòng)過程中不易避免的一種現(xiàn)象，目前對(duì)于牙根吸收的檢查、診斷手段有限[1]，臨床上主要應(yīng)用X線片，但其具有滯后性、靜態(tài)性等不可避免的局限性，而且確立診斷后也沒有行之有效的治療措施。因此，早期診斷、監(jiān)測(cè)牙根吸收的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)于正畸導(dǎo)致的牙根吸收的基礎(chǔ)研究和正畸臨床工作都有很大的意義。牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialoph-osphoprotein，DSPP）和牙本質(zhì)涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）屬于牙本質(zhì)特異性蛋白，在人的一生中牙本質(zhì)不斷地沉積，這些蛋白通常不被釋放到周圍組織中，而在牙根吸收活動(dòng)期牙本質(zhì)重塑的時(shí)候，這些蛋白會(huì)釋放到牙周膜間隙。近年，齦溝液分析技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，由于其具有方便、無創(chuàng)、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，目前在牙周臨床檢查中廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，建立實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)致牙根吸收模型，通過Western blot等手段研究大鼠齦溝液中DSPP/DSP的表達(dá)，為利用分子生物學(xué)方法早期診斷、監(jiān)測(cè)牙根吸收提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠36只（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重0.25 kg±0.02 kg，普通飼料分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 牙移動(dòng)致牙根吸收模型的建立

將36只Wistar大鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、輕力組和重力組，每組12只。在輕力組和重力組動(dòng)物的右側(cè)上頜切牙和第一磨牙間置NiTi螺簧，以左右上頜切牙為支抗，分別以0.392 N、0.98 N力拉右側(cè)上頜第一磨牙向近中移動(dòng)。對(duì)照組動(dòng)物予以偽實(shí)驗(yàn)。每日檢查裝置是否脫落或損壞。隔天測(cè)定力值，隨時(shí)調(diào)整NiTi螺簧，以保持力值恒定（圖1）。

圖1 大鼠牙齒移動(dòng)模型Fig 1 The model of tooth movement of rat

1.3 齦溝液提取及處理

加力7 d后，提取各組動(dòng)物齦溝液并進(jìn)行樣本處理。將大鼠麻醉后固定，干燥右側(cè)上頜磨牙及周圍牙齦黏膜，鈍性牙周探針工作端背部輕壓受試牙腭側(cè)牙齦邊緣，使游離齦與牙面輕微分開，將預(yù)先剪掉尖端0.5mm并已高溫高壓消毒的15號(hào)吸潮紙尖（北京達(dá)雅鼎醫(yī)療器械有限公司）輕輕插入右側(cè)上頜第一磨牙近、遠(yuǎn)中腭側(cè)齦溝內(nèi)至有輕微阻力即停止（約1.0mm深），留置30 s后取出，間隔1min后重復(fù)2次，帶血樣本棄去，將紙尖密封于已消毒好的微型離心管中。加入1%的磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）120μL，常溫下洗脫1 h，15 000 r·min-1離心5min使蛋白溶解于緩沖液中，棄去吸潮紙尖，提取100μL上清液。-70℃保存上清液。

1.4 組織標(biāo)本的制備

所有動(dòng)物于提取齦溝液后，應(yīng)用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注處死。切取上頜骨組織（實(shí)驗(yàn)側(cè)上頜磨牙區(qū)及其周圍牙槽骨組織），將標(biāo)本固定于4%多聚甲醛液中48 h后，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）常溫脫鈣6周，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規(guī)石蠟包埋。將標(biāo)本沿磨牙長(zhǎng)軸進(jìn)行近遠(yuǎn)中向連續(xù)切片，每張厚約5μm。選取可見到上頜第一磨牙近中牙根根管的組織切片行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色以觀察移動(dòng)牙周圍牙槽骨及牙根吸收的情況。

1.5 齦溝液樣本的Western blot分析

4℃下，利用Bradford方法確定各齦溝液樣本中的蛋白含量，保證上樣時(shí)總蛋白量相等。然后制備凝膠，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行蛋白印跡（Western blot分析）。利用BandScan 5.0圖像分析軟件測(cè)定各組樣本中DSPP、DSP的灰度值，并對(duì)其蛋白條帶的灰度進(jìn)行掃描分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組樣本均數(shù)的LSD檢驗(yàn)，分別比較3組樣本中DSPP、DSP兩種蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 大體標(biāo)本觀察

對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)牙無明顯變化，第一磨牙和第二磨牙間無間隙。輕力組：實(shí)驗(yàn)牙明顯近中移動(dòng)，第一磨牙和第二磨牙間間隙平均約1.5mm。重力組：實(shí)驗(yàn)牙近中移動(dòng)少許，第一磨牙和第二磨牙間無間隙或有少量間隙（不足0.5mm）。

2.2 組織學(xué)結(jié)果

3組標(biāo)本的組織學(xué)觀察結(jié)果見圖2和3。對(duì)照組：未見明顯的牙根吸收和骨吸收。輕力組：未見明顯的牙根吸收及破牙骨質(zhì)細(xì)胞，但骨吸收明顯，且多為直接骨吸收，在牙槽骨骨吸收陷窩內(nèi)可見多核破骨細(xì)胞，TRAP染色陽性。重力組：根尖1/3遠(yuǎn)中區(qū)及根分叉附近出現(xiàn)明顯牙根吸收現(xiàn)象，牙骨質(zhì)大面積嚴(yán)重吸收，絕大多數(shù)累及牙本質(zhì)，吸收區(qū)可見多核破牙本質(zhì)細(xì)胞，根吸收區(qū)附近的牙槽骨多數(shù)可見破骨活動(dòng)，牙槽骨內(nèi)可見潛掘性骨吸收，TRAP染色在牙根吸收和骨質(zhì)吸收處可見陽性細(xì)胞。

圖3 輕力組標(biāo)本的組織學(xué)觀察結(jié)果 TRAP ×400Fig 3 Results of histological observation of light force group TRAP ×400

2.3 Western blot分析結(jié)果

Western blot分析結(jié)果見圖4，從圖4可見，對(duì)照組中有1條目的蛋白帶，輕力組和重力組各有2條目的蛋白帶。根據(jù)分子量判斷，對(duì)照組中的目的蛋白帶為DSPP，輕力組和重力組中的2條目的蛋白帶為DSPP和DSP。

圖4 Western blot分析結(jié)果Fig 4 The results of Western blot analysis

3組齦溝液樣本中DSPP、DSP的條帶灰度值比較見圖5。統(tǒng)計(jì)分析表明：3組大鼠齦溝液中DSPP、DSP蛋白的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），重力組中2種蛋白表達(dá)最高，輕力組次之，對(duì)照組最低。

圖5 3組齦溝液樣本中DSPP、DSP的條帶灰度值比較Fig 5 The gray value of DSPP,DSP among the gingival crevicular fluid of three groups

3 討論

3.1 牙本質(zhì)磷蛋白、牙本質(zhì)涎蛋白在牙本質(zhì)形成過程中的作用

牙本質(zhì)涎磷蛋白和/或由其編碼的兩種蛋白質(zhì)——牙本質(zhì)磷蛋白和牙本質(zhì)涎蛋白參與前期牙本質(zhì)礦化為牙本質(zhì)的過程，在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化、牙本質(zhì)基質(zhì)形成、礦化及穩(wěn)定性維持等方面均起到非常重要的作用[2-5]，并且還具有誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)生成的功能[6-7]。

Nakashima等[8]的研究表明：DSP在牙髓損傷后第三期牙本質(zhì)的形成過程中表達(dá)增強(qiáng)，提示當(dāng)成牙本質(zhì)細(xì)胞受到破壞時(shí)，未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分泌基質(zhì)、基質(zhì)蛋白及生長(zhǎng)因子，促進(jìn)牙髓的自身修復(fù)，DSP在這一過程中發(fā)揮重要作用。張蓉等[9]對(duì)DSPP在牙髓異常狀態(tài)下的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，結(jié)果也提示DSPP可能在牙髓損傷后的早期自身修復(fù)中起作用。

在正畸治療導(dǎo)致牙根吸收時(shí)，牙齒同樣會(huì)發(fā)生自身防御性反應(yīng)而形成修復(fù)性牙本質(zhì)，在這種牙根吸收造成牙齒損傷后牙齒的自身修復(fù)過程中，DSPP、DSP是否發(fā)揮作用以及其表達(dá)情況究竟如何呢？本研究以大鼠為研究對(duì)象，建立齦溝液提取方法和牙移動(dòng)致牙根吸收模型，通過Western blot手段比較各組動(dòng)物齦溝液樣本中DSPP、DSP的表達(dá)，進(jìn)一步探討牙本質(zhì)磷蛋白、牙本質(zhì)涎蛋白在牙本質(zhì)形成過程中的作用。

3.2 動(dòng)物模型參數(shù)的建立

目前研究[10-14]中采用NiTi拉簧拉第一磨牙向近中傾斜移動(dòng)的參考力值有0.294、0.392、0.490、0.588、0.833 N不等。King等[10]采用NiTi拉簧，以上頜雙側(cè)切牙為支抗拉第一磨牙向近中傾斜移動(dòng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：0.294～0.588N力是較適合的正畸力，此時(shí)大鼠磨牙發(fā)生明顯近中移動(dòng)而未出現(xiàn)牙根吸收。學(xué)者[15-17]研究表明：對(duì)大鼠磨牙使用0.784 N或0.980 N正畸力時(shí)，牙周組織中破骨細(xì)胞的數(shù)量減少，牙周組織透明性變區(qū)范圍大而廣，牙齒移動(dòng)速度慢于輕力組，并可見潛掘性骨吸收和不同程度的牙根吸收，在加力3 d時(shí)即出現(xiàn)牙根吸收，加力7 d時(shí)牙根吸收達(dá)到峰值；而0.392N或0.490N力值組的細(xì)胞反應(yīng)較為活躍，整個(gè)加力周期內(nèi)（14 d）牙周組織破壞較小，透明性變區(qū)范圍小，主要引起直接性骨吸收。由于本實(shí)驗(yàn)旨在探尋大鼠齦溝液中DSPP和DSP的表達(dá)是否與牙移動(dòng)所致牙根吸收有關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)輕力組選用0.392N力，重力組選用0.980N力，并選擇加力7 d時(shí)處死動(dòng)物觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組齦溝液樣本中有DSPP表達(dá)，無DSP表達(dá)，提示在正常狀態(tài)下，牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可能以DSPP的形式存在，并且釋放到齦溝液中。DSPP的功能可能與繼發(fā)性牙本質(zhì)一直持續(xù)不斷地形成有關(guān)，其在牙本質(zhì)形成、礦化過程中起一定作用[18]。輕力組牙移動(dòng)齦溝液樣本中DSPP、DSP均有表達(dá)，且表達(dá)量高于對(duì)照組。提示在矯治施力過程中，力對(duì)牙體組織的刺激會(huì)引起牙齒的防御和/或反應(yīng)性變化，從而引起成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌DSPP的量明顯增多，DSPP在發(fā)揮作用過程中裂解，作為裂解片段之一的DSP亦釋放到牙周組織中，在齦溝液中有所表達(dá)。重力組牙移動(dòng)齦溝液樣本中同時(shí)有DSPP、DSP的表達(dá)，且表達(dá)量高于其他兩組。這一結(jié)果與Balducci等[19]的研究結(jié)果相一致。這提示，在重力牙移動(dòng)引起牙齒牙骨質(zhì)大面積吸收甚至侵及牙本質(zhì)時(shí)，牙齒發(fā)生自身防御性反應(yīng)形成修復(fù)性牙本質(zhì)，在這一過程中，部分成牙本質(zhì)細(xì)胞受到刺激發(fā)生變性，牙髓深層的未分化間充質(zhì)細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，分泌牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)并礦化形成修復(fù)性牙本質(zhì)[20]。此時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中DSPP的表達(dá)量明顯增多，并且裂解反應(yīng)增加，故DSP在齦溝液中的表達(dá)顯著增加。即在牙根吸收等牙齒損傷的發(fā)展過程中，隨著損傷程度的增加，齦溝液中DSPP、DSP濃度隨之增加，且這些蛋白表達(dá)增強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)可能發(fā)生在臨床上或組織學(xué)上探測(cè)到牙齒損傷之前。

3.4 臨床意義與展望

目前臨床工作中，牙根吸收的診斷、檢測(cè)主要依賴X線檢查，然而X線只有在礦化組織喪失60%～70%時(shí)才能發(fā)現(xiàn)牙根吸收，即在治療5～6個(gè)月后牙根吸收才可以有可靠的X線診斷[1]，具有一定的滯后性。所以，尋找一種新的評(píng)估方法早期診斷、監(jiān)測(cè)牙根吸收，對(duì)于正畸臨床工作有很大的意義。

本實(shí)驗(yàn)3組樣本中DSPP和DSP的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中重力組2種蛋白表達(dá)最高，輕力組次之，對(duì)照組最低，提示齦溝液中DSPP和/或DSP參與了正畸所導(dǎo)致的牙根吸收的過程，同時(shí)提示DSPP和/或DSP可能作為一種生物學(xué)指標(biāo)，用于牙根吸收有X線表現(xiàn)或者臨床表現(xiàn)之前對(duì)牙根吸收進(jìn)行早期診斷和檢測(cè)，從而提醒臨床醫(yī)生采取適當(dāng)措施預(yù)防或阻斷牙根吸收的發(fā)生、發(fā)展。當(dāng)然，今后尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來探討DSPP、DSP在牙根吸收發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，并通過時(shí)間軸上的縱向研究尋找2種蛋白在齦溝液中濃度表達(dá)的變化規(guī)律，進(jìn)而得到預(yù)示牙根吸收發(fā)生的準(zhǔn)確濃度，從而進(jìn)一步指導(dǎo)相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

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（本文編輯 李彩）

Relationship between orthodontics root resorption follow ing experimental tooth movement and the level of dentin sialoph-osphoprotein and dentin sialoprotein in gingival crevicular fluid

ZUO Zhi-gang1,HU Min1,JIANG Huan1,TIAN Li2.（1.Dept.of Orthodontics,College of Stomatology,Jilin University,Changchun130021,China;2.Key Laboratory for Molecular Enzymology and Engineering,The Ministry of Education,Jilin University,Changchun130021,China）

ObjectiveTo investigate the relationship of expression of dentin sialoph-osphoprotein（DSPP）and dentin sialoprotein（DSP）in gingival crevicular fluid（GCF）with root resorption following experimental tooth movement in rats. Methods 36 Wistar rats were divided into 3 groups on average randomly:Control group,light force group and heavy force group.The experimental teeth were drawn-off mesially by the force of 0.392N in light force group and 0.98N in heavy force group,with both of the maxillary central incisors as the tooth of anchorage.At the 7th day,the gingival crevicular fluid of rats were collected;the histological slices were made,including the experimental tooth and periodontal tissue;the tissues was stained with hematoxylin-eosin（HE）staining and tartrate resistant acid phosphatase（TRAP）staining to observe the histological changes of the root resorption of rats.Then the expression of DSPP and DSP were assayed by using biochemistry techniques of Western blot.Results Histological observation:There was not root resorption in control group.Neither root resorption nor cementoclast was observed in light force group.And in heavy force group visible root resorption came out in pressure zone.Western blot results:There was expression of DSPP and no DSP in control group,and there was the expression of DSPP and DSP in both light force group and heavy force group. The result of statistical analysis showed that there were significant differences in the expression of DSPP and DSP among three groups.The highest one was heavy force group,followed by the light force group and control group with the least amount of proteins.ConclusionThere is the expression of DSPP and DSP in gingival crevicular fluid following experimental tooth movement with root resorption.

root resorption； gingival crevicular fluid； dentin sialoph-osphoprotein； dentin sialoprotein

R 783.5

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.019

1000－1182（2011）03－0294-05

2010-07-23；

2010-09-10

吉林省科技廳基金資助項(xiàng)目（20080042-1）

左志剛（1982—），男，河北人，住院醫(yī)師，碩士，現(xiàn)在天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科工作

胡敏，Tel：0431-85579339